[發明專利]一種赤靈芝菌株鑒定方法

在審

• 申請號: 201710083251.4
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106755520A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 孫君社;姚松君;孫恬;劉鳳松;張秀清;王超;馬務迢;劉偉賢
• 申請（專利權）人: 無限極（中國）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及食用菌種質鑒定技術領域，尤其涉及一種赤靈芝菌株鑒定方法。

背景技術

靈芝在分類系統上隸屬于真菌門(Eumycota)，擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層擔子菌綱(Hymenomycetes)，無隔擔子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)、非褶菌目(Aphyllophorales)、靈芝菌科(Ganodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)。赤靈芝學名為(Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)。

對于赤靈芝菌種的鑒定，傳統的鑒定方法主要是依賴于形態學觀察，包括對靈芝子實體的形、色、氣、味、質地等外觀形狀觀察等。該方法簡便易行，但主觀性強，準確性完全依賴于檢測者的經驗判斷。

從分子遺傳學角度來看，物種表現型的差異歸根結底應追溯到基因型的差異，即在DNA序列上的差異。后來出現了基于DNA序列的分子標記技術，常用的DNA分子標記技術包括RFLP、RADP、SSR、ISSR、AFLP等。DNA的分子標記技術可以彌補和克服傳統鑒定方法的一些缺陷，在赤靈芝菌種的鑒定中也取得了良好的應用效果。

但是，現有的分子標記技術主要集中對特征序列的擴增及測序，而利用特征序列僅可以確定靈芝的種屬。然而由于屬于同一物種，當面對需要對赤靈芝的不同菌種進行鑒定時，現有的分子標記技術并不能滿足需求。因此，進一步開發能夠用于赤靈芝不同菌株的鑒定方法十分必要。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種赤靈芝菌株鑒定方法。利用存在于ITS1序列中的SNP位點，本發明提供的方法能夠將赤靈芝菌種203與其他菌種區分，準確率可達100％。

本發明提供了ITS1序列的SNP位點在赤靈芝菌株鑒定中的應用；

ITS1序列的SNP位點位于ITS1序列5’端的第180位核苷酸。

本發明中，赤靈芝菌株為赤靈芝203。

本發明中，ITS1序列5’端的第180位核苷酸為T則所述赤靈芝菌株為赤靈芝203。

本發明中，利用ITS1序列SNP位點能夠區分的赤靈芝菌株為赤靈芝203(Ganoderma lucidum 203)，東北赤靈芝(Ganoderma lucidum DB)，金寨喬康赤靈芝(Ganoderma lucidum JQ)，日本赤靈芝(Ganoderma lucidum RB)。

ITS序列是內源轉錄間隔區(Internally Transcribed Spacer)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之間，分別為ITS 1和ITS 2。本發明的通過提取赤靈芝菌種及其制品的DNA，對ITS全長序列進行擴增及測序，將測序得到的ITS序列依據隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Models)使用HMMER suite軟件進行比對注釋，得到ITS1序列全長。將注釋得到的ITS1序列在本地用DNAMAN軟件比對。如果該ITS1序列從5’端開始的第180位為T則為赤靈芝菌種203，如果為C則不是該菌株。經分析，赤靈芝203菌種ITS1序列如SEQ ID NO:3所示。

本發明還提供了由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組。

本發明提供的引物組能夠對ITS序列進行全長擴增。然后通過分析其中ITS1序列中的SNP位點，從而實現對赤靈芝203菌種的鑒定。

所述引物組的退火溫度為54℃。

本發明提供的引物組在制備鑒定赤靈芝菌株的產品中的應用。

本發明還提供了一種鑒定赤靈芝菌株的試劑盒，包括由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組。

本發明提供的試劑盒還包括PCR反應試劑。

所述PCR反應試劑包括Taq酶，dNTP，Mg²⁺、擴增緩沖液、ddH₂O。

所述PCR反應試劑可混合，也可為混合試劑。優選為混合試劑。更優選，混合試劑中還包括DNA染色劑。優選的，DNA染色劑為Loading Dye。

本發明還提供了一種鑒定赤靈芝菌株的方法，以由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組對待測樣品的DNA進行擴增，根據擴增所得片段的SNP位點判斷赤靈芝的菌株種類；