[發明專利]一種新型致病性蠟樣芽孢桿菌HB?SS?1及其培養方法和應用

在審

• 申請號: 201710082253.1
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106701639A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 郭銳;田永祥;周丹娜;楊克禮;段正贏;劉澤文;袁芳艷;劉威
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;A61K39/07;A61P31/04;C12R1/085
• 代理公司: 北京彭麗芳知識產權代理有限公司11407
• 代理人: 彭麗芳

技術領域

本發明涉及菌株領域，具體涉及一種新型致病性蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1及其培養方法和應用。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus，B.C)在土壤等環境中廣泛存在，是一種需氧型的芽孢桿菌，其產生豐富的蛋白酶、SOD、淀粉酶及抑菌物質等代謝產物。微生態制劑，以蠟樣芽孢桿菌為主要細菌，可以克服很多副作用，例如使用抗生素作為飼料和藥品添加劑所帶來的副作用，人和動物腸道微生態系統失調、免疫力下降、藥物殘留及產生抗藥性等。B.C菌類制劑大多為非消化性藥劑或食品添加劑，能選擇性促進生活在腸道的微生物的活性，同時抑制腸道內有害病菌的生長，降低宿主染病的機會，使宿主保證健康。另外，B.C菌在生長過程中還會產生有益的代謝產物，刺激和促進宿主的生長。

B.C菌雖然在其作為有益菌方面已獲得了長足的發展和足夠的重視，但是B.C菌也是一種條件致病菌，在一定旳條件下也會對動物機體造成很強的致病性，因此它危害也應該引起我們足夠的重視。研究表明，該菌同昆蟲病原菌蘇云金桿菌、人畜病原菌、炭疽芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、韋氏芽抱桿菌組成芽孢桿菌屬蠟樣芽孢桿菌組，它們的形態特征、生理生化特征非常相似并有著極高的同源性，該菌也曾被多次報道引起人食物中毒、以及在養殖過程中引發部分動物疾病等。鑒于B.C菌包含有益菌株和致病性菌株，因此在使用前應首先確定菌株是否為致病菌株，確保其安全性。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種新型致病性蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1及其培養方法和應用。

為實現上述目的，發明人從發病麋鹿群中分離到了一株新型致病性蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)HB-SS-1，所述菌株于2016年11月24日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢武昌珞珈山，保藏編號為：CCTCC NO：M2016672。

所述(Bacillus cereus)HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明還提供了上述新型致病性蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)HB-SS-1的分離純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、培養基配制

TSA固體培養基配制：準確稱取TSA粉末40g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至50-60℃時，加入過濾除菌的羊血清60mL，混合均勻后倒板備用；

TSB液體培養基配制：準確稱取TSB粉末30g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121℃高壓蒸汽滅菌15min，臨用前加入過濾除菌的羊血清60mL即可；

S2、分離純化

選取發病麋鹿的肺、胸水、心包液、關節液接種TSA/NAD固體培養基，置37℃、5％CO₂條件下培養24-48小時，挑取乳白色的圓形光滑小菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陽性小桿狀菌，再進行兩次TSA/NAD固體培養基亞克隆培養。

本發明人對該菌株進行了一系列生物學特性試驗如：細菌純化培養、涂片染色鏡檢、生化試驗、藥敏試驗、PCR鑒定、動物實驗。試驗結果證實該菌株16SrDNA序列與炭疽桿菌部分菌株序列一致，通過動物實驗證明HB-SS-1有較強毒力，能夠致死實驗小白鼠，該毒株可作為以后防疫麋鹿細菌病的候選疫苗菌株，可用于制備蠟樣芽孢桿菌病疫苗。

附圖說明

圖1為本發明實施例中HB-SS-1菌株培養基生長形態。

圖2為本發明實施例中HB-SS-1菌株革蘭氏染色鏡檢。

圖3為本發明實施例中HB-SS-1菌株16SrDNA基因進化樹。

表1生化鑒定試驗結果

注：″+″表示只產酸或陽性，″-″表示陰性

表2 HB-SS-1株藥敏試驗結果

注：S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐藥。

表3半數致死量測定試驗結果

具體實施方式

為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1株的分離純化和鑒定。

培養基配制