[發明專利]一種從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法

在審

• 申請號: 201710080722.6
• 申請日: 2017-02-15
• 公開（公告）號: CN106801045A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 鄭剛;曲麗麗;泮紅文;楊志堅;陳磊;陳逸文;戴林偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學舟山海洋研究中心
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/685
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 趙杭麗

技術領域

本發明屬于工業中分離纖維素酶的方法，涉及一種從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法。

背景技術

纖維素酶是地球上分布最廣、最廉價、含量最豐富的多糖類物質，對人類而言，它同時又是自然界數量最大的可再生能源，它的降解是自然界碳循環的中心環節。纖維素酶能夠通過水解作用將纖維素物質徹底降解，其水解產物能夠進一步發酵生產乙醇、氫氣及生產生物柴油的原料油脂等。因此，利用纖維素酶轉化纖維素對于解決目前世界環境污染以及能源危機等問題具有十分重要的意義。目前，纖維素酶已被廣泛用于洗滌劑工業、麻棉混紡織物后整理工業、食品工業、飼料工業、水產養殖行業，而且取得了良好的效果。

生產纖維素酶的微生物多種多樣，有細菌、真菌、放線菌等，目前基本上均為陸生微生物，用陸生微生物生產的纖維素酶，其穩定性和環境耐受性一般都不是特別理想，而纖維素植物的降解一般均需要在粗獷的條件下進行，其纖維素降解效率常受到限制。海洋微生物由于其環境所致，具有不同于陸生微生物的獨特技能。海洋寡養、高鹽的獨特環境為孕育出顯著不同于陸生微生物特性的微生物提供了一個特殊的環境。生活在寡養環境的微生物往往具有降解大分子物質成為自身可利用的營養物質的酶系，纖維素酶的降解為可利用的糖類是寡養環境里的微生物采用的有限獲取營養的主要方式。

纖維素酶的制取方法有兩種：液體發酵和固體發酵，固體發酵具有液體發酵沒有的優勢，菌絲能有效附著在固體發酵基質表面，提高發酵效率、比酶活高，設備單位體積生產能力高，因此固體發酵成為發酵生產工業化的一個重要方向。

從發酵液中分離提取纖維素酶的工業級制備方面，柱層析分離方式由于高成本與操作的復雜性等原因很難有效的放大到工業規模。目前，工業中纖維素酶的分離方法主要有硫酸銨鹽析和乙醇沉淀等。但是硫酸銨鹽析后會產生大量的鹽較難除去與回收，而乙醇沉淀的成本又相對較高，從而制約了木質纖維素原料及纖維素酶的大規模工業化應用。

發明內容

本發明的目的在于針對一般提取纖維素酶方法的弊端,提供一種從微生物海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法,本發明采用改進的單寧沉淀法分離提取經產纖維素酶微生物發酵產生的纖維素酶,并采用真空冷凍干燥法制備成粉末狀纖維素酶產品,使纖維素酶的回收率能夠達到90-95％,具有用時短，能耗小，操作簡單，纖維素酶收率高的優點,克服了分離提取 纖維素酶階段在整個木質纖維素制乙醇工藝中成本過高！操作復雜等難題,適用于纖維素酶工業化大規模制備。

本發明從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法通過以下步驟實現：

1、發酵液澄清：將海洋微生物固態發酵7-8天后生產的固態發酵液進行過濾、離心，得到發酵澄清液；所述的海洋微生物為海洋黑曲霉菌，Aspergillus sp.ZJUBE2010,保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏編號：CCTCC NO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日；

2、單寧沉淀：將上述發酵澄清液加入攪拌罐中,以一定的轉攪拌一定時間,將一定量的單寧溶液加入攪拌罐中的發酵澄清液中,并持續攪拌一定時間,然后靜置1-2h，進行纖維素酶的沉淀；

3、沉淀收集：將經過單寧沉淀的發酵液以一定的進行離心，上清液去掉，收集沉淀；

4、沉淀復溶：將上述沉淀用一定體積的濃度為20mg/ml的聚乙二醇溶液復溶，并持續攪拌一定時間，然后靜置1-2h，進行復溶；

5、產品收集：將上述溶液，置于離心機中以一定的轉速離心一段時間，上清液即為濃縮之后的纖維素酶液，將濃縮液置于真空冷凍干燥機中干燥制得粉末狀纖維素酶產品。

所述的從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法中,對步驟1中得到的所述發酵澄清液和步驟4中經單寧沉淀聚乙二醇解析之后收集到的纖維素酶液分別用濾紙酶活力測定方法測定其纖維素酶活力。

所述的從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟2中單寧的用量按照10g/L的用量向發酵澄清液中添加。

所述的從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法中步驟2和步驟4中，攪拌的轉速為80r/min,攪拌時間為10min。

所述的從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟3和步驟5中，離心的轉速為4000r/min，離心時間為20min。

所述的從海洋黑曲霉發酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟4中，聚乙二醇溶液的濃度為20g/L，溶質為分子量為6000的PEG，溶劑為自然水。