[發明專利]一種乙型肝炎病毒cccDNA的數字微滴PCR檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201710080657.7
• 申請日: 2017-02-15
• 公開（公告）號: CN108441578A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 張繼明;江培學;毛日成
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種乙型肝炎病毒cccDNA的數字微滴PCR 檢測方法，其特征在于，其包括：

在按下述方法設計的引物和探針存在下，用PSAD 酶預處理乙肝病毒DNA，實現對HBVcccDNA 特異性檢測：

1) 根據HBV 全序列，在HBV 基因組前C 編碼區，設計并合成如下序列的引物和探針：

PCR引物F ：5’-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3’(nt1547-nt1565)

PCR引物R ：5’-CCCCAAAGCCACCCAA-3’(nt1902-nt1887)

2) 組成乙型肝炎病毒cccDNA數字微滴PCR 診斷試劑盒；

3) 制備反應液；

4) PSAD 酶處理HBV DNA；

5) 定量檢測待測樣品中HBVcccDNA 的含量。

2.按權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟3）中，反應液每份為26μl，每份反應液中含組分：5×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，2.5mmol/LMgCl2，引物HBV-F和HBV-R 各0.2μmol/L， DNA 聚合酶1U。

3.按權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟4）中，在25μl 總反應體系中：依次加進1μl 25mM ATP，2.5μl10 倍的Buffer，提取的乙肝DNA 模板溶液12.5μl，和0.5μl 的質粒保護DNA 酶，再用25μl，將反應體系置于37℃環境中溫育30min，70℃滅活30min。

4.按權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟5）中，定量檢測待測樣品中HBVcccDNA 的含量：PSAD 酶處理的HBVcccDNA，濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml 的5 個標準品各4μl，各加入步驟(3) 制得的反應液26μl，分別放入各個反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品反應管的擴增結果與其它反應管擴增結果比較，得出待測樣品中HBVcccDNA 的含量。

5.按權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟5）中，所述的擴增是于伯樂微滴數字PCR儀中進行擴增：擴增時的溫度條件依次為50℃下2 分鐘、94℃預變性4 分鐘、94℃下15 秒、60℃ 45 秒構成一個循環，共40 個循環。

6.一種乙型肝炎病毒cccDNA數字微滴PCR 檢測試劑盒，其特征是：該試劑盒包括成分：如權利要求1所述的一對特異性HBV引物， Taq 酶，Plasmid-Safe ATP-dependent DNase酶，乙型肝炎病毒cccDNA陽性對照，和陰性對照和PCR Buffer。