[發明專利]一種擬穴青蟹抗病因子SpALF6單核苷酸突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710080642.0
• 申請日: 2017-02-15
• 公開（公告）號: CN106928333B
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 李新蒼;仉曉文;房文紅;王元;趙姝
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;C12Q1/6888;A61K38/17;A61P31/10;A61P31/04;A23K20/147;A01K61/59;C12R1/19
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司 31203
• 代理人: 陸林輝

本發明涉及一種擬穴青蟹抗病因子SpALF6單核苷酸突變體及其制備方法和應用。本發明涉及水產動物新型天然藥物與飼料添加劑開發和應用技術領域，具體是一種擬穴青蟹抗病因子SpALF6單核苷酸突變體SpALF6?M，其全長核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，全長氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本發明還提供SpALF6?M的制備方法和應用。本發明制備的SpALF6?M對真菌和病原性細菌(特別是耐藥性弧菌)具有明顯的抑制和殺傷作用，表明其在抗微生物感染新藥和新型抗病飼料添加劑的開發和應用方面具有非常誘人的應用前景。

技術領域

本發明屬水產動物新型天然藥物與飼料添加劑開發和應用技術領域，特別涉及一種擬穴青蟹抗病因子SpALF6單核苷酸突變體SpALF6-M，及其制備方法和應用。

背景技術

擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國乃至世界重要的海水經濟蟹類。擬穴青蟹又稱青蟹，屬節肢動物門、甲殼綱、十足目、青蟹屬，在我國主要分布于東南沿海近海海域，目前在長江口區域如崇明島也有養殖，屬我國傳統海洋漁業資源和海水養殖蟹類，具有重要經濟價值。青蟹具有生長快、體型大、肉味鮮美等優點，深受消費者青睞。青蟹養殖主要分布在東南沿海區域，近年來，養殖區域已擴大到長江口流域，經形成了較大的養殖規模，養殖青蟹年產量一直穩定在10萬噸以上，保持了穩定的發展勢頭。

目前，病害是制約青蟹養殖業發展的重要瓶頸。培育抗病能力強的青蟹新品種是促進青蟹養殖業健康發展的一個重要任務。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)首次發現于鱟體內，因該因子具有抗凝血作用，能夠抑制細菌脂多糖(LPS)引發的凝集反應，故命名為抗脂多糖因子。最早發現的鱟LALF對R-型革蘭氏陰性菌具有強烈的抑制作用。隨后對ALF的分子結構進一步研究表明，ALF對LPS具有高親和力，能夠結合LPS類脂A并中和其生物學活性。目前，多種甲殼動物ALF在對蝦、螯蝦、蟹等動物體內相繼被鑒定。該類蛋白對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌、真菌及WSSV等具有不同程度的殺滅或抑制作用，表明ALF是動物體內重要的抗病因子。

目前水產養殖動物中細菌耐藥現象較為普遍，常規藥物使用經常達不到預期效果，不但藥物使用浪費，還不能挽回因病害帶來的經濟損失，因此開發新型抗耐藥菌藥物也是水產病害防治的一個重要課題。在創制本發明過程中，我們發現該蛋白對常見水產動物病原具有廣譜抗菌活性，特別是對耐藥性溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌也具有顯著抑制效果，因此該蛋白在制備抗水產動物飼料添加劑方面具有光明的應用前景。此外，SpALF6的單氨基酸突變體SpALF6-M對真菌抑菌活性顯著增強，特別是對白色念珠球菌生長抑制活性。雖然目前的研究顯示ALF家族蛋白具有較為廣譜的抗微生物活性，但該類蛋白抗白色念珠球菌活性的報道卻很少，鑒于白色念珠球菌是包括人在內高等動物病原，通過一定的途徑獲取SpALF6-M蛋白可以作為新型抗真菌藥物。

此外，大腸桿菌表達系統是制備蛋白產品有效方法，由于該方法產量大、成本低、制備過程相對簡單，是目前大量獲取外源蛋白的主要途徑。在創制本發明專利過程中，發現SpALF6-M可在本研究構建的大腸桿菌表達系統中可溶性表達。與蛋白表達過程中形成不可溶的包涵體相比，生產工藝和成本會顯著降低，因此本發明所創制的SpALF6-M制備方法為新型藥物和水產飼料添加劑的開發和推廣應用創造了條件。

發明內容

本發明的目的在于提供一種擬穴青蟹抗病因子SpALF6單核苷酸突變體SpALF6-M，及其制備方法和應用。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種擬穴青蟹抗病因子SpALF6，其全長cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SpALF6的全長cDNA(SEQ ID NO:1)為681bp，其中第79位至第426位的核苷酸為編碼氨基酸序列的開放閱讀框(SEQ ID NO:5)，全長348bp。