[發明專利]淡水中毒力基因為Stx1的大腸桿菌的快速篩選方法

在審

• 申請號: 201710079421.1
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106868120A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 曲克明;張旭志;單秀娟;趙俊;張艷;李秋芬;陳聚法;丁東生
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種淡水中毒力基因為Stx1的大腸桿菌的快速篩選方法，其特征在于它的步驟包括樣品收集、預過濾、富集游離DNA、清洗和環介導等溫基因擴增鑒定五個步驟。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的樣品收集步驟，指原位收集不少于1.0L的待測定淡水。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的預過濾步驟，采用水系微孔濾膜過濾所收集的淡水樣品，除去不溶性物質。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述的水系微孔濾膜孔徑為0.45μm。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的富集游離DNA步驟，首先向過濾后的樣品中加入HCl或H₂SO₄，調節pH至4.9～5.8，再采用硅膠膜過濾，富集游離DNA到膜上。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的清洗步驟是在樣品完全過濾后，再加上純水，洗去干擾小分子和離子。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的環介導等溫基因擴增步驟，首先將硅膠膜平均分成4份，每份裝入一個反應管，然后加入包括引物、酶在內的擴增反應試劑和指示劑，封閉反應管，放入61-65℃溫度下反應；同時做陽性和陰性對照，指示劑顏色變化指示環介導等溫基因擴增結果，陽性結果說明所測定淡水樣品中有目標基因，即表明毒力基因為Stx1的大腸桿菌具有存在可能性。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的反應管是透明的玻璃管、有機玻璃管或塑料管。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的指示劑為鈣黃綠素或羥基萘酚藍。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的各步驟，均采用無菌、無DNA污染的潔凈器具。