[發明專利]海洋高等植物腐葉總DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201710078059.6
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106591296A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 丁媛媛;陳小勇
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海藍迪專利商標事務所(普通合伙)31215
• 代理人: 徐筱梅,張翔

1.一種海洋高等植物腐葉總DNA的提取方法，其特征在于，該方法包括以下具體步驟：

a)取海洋高等植物腐葉，用液氮研磨，磨碎后加入洗脫液，0.1g腐葉加1-2ml洗脫液，轉入離心管中，在高速冷凍離心機上10,000rpm，0-10℃離心10-15min；

b)棄上清液，立即添加預熱至50-65℃的提取緩沖液，0.1g腐葉加0.5-1ml提取緩沖液，用攪拌棍充分攪拌均勻；50-65℃水浴10-30min；期間每10分鐘上下混勻一次；水浴結束后取出冷卻至室溫；

c)加入與提取緩沖液等體積的氯仿與異戊醇的混合液，上下顛倒離心管數次，直到形成乳濁液為止；在高速冷凍離心機上，以13,000rpm，0-10℃離心10-15min；其中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1；

d)吸取上清液，轉移至一標記好的新離心管中，加入等體積的氯仿與異戊醇的混合液，13,000rpm，0-10℃離心10-15min；

e)吸取上清液，加入10mg/ml的RNaseA，400μl上清液加入2-3μl RNaseA,35-40℃水浴10-60min，冷卻至室溫；

f)加入等體積的氯仿與異戊醇的混合液，使之形成乳濁液，13,000rpm，0-10℃離心10-15min；

g)吸取上清液，加入2倍體積預冷為-20℃的無水乙醇，輕輕地混勻，出現白色絮狀沉淀，將混合物置于-20℃冷凍10-60min；

h)13,000rpm，0-10℃離心10-15min；將上清液從離心管中倒出，保留沉淀在離心管中；

i)加入預冷的1-2ml 70％乙醇以清洗沉淀，10,000rpm，0-10℃離心5-10min；

j)棄上清液，將離心管倒置于鋪有吸水紙的工作臺上，自然風干,得到DNA沉淀；

k)加入TE緩沖液，以溶解沉淀；得到所述海洋高等植物腐葉總DNA儲存液；其中：

所述海洋高等植物包括海草類和紅樹植物類；

所述洗脫液為100mmol/L的Tris-HCl，pH 8.0、1.4mol/L的NaCl、20mmol/L的EDTA、質量濃度為20g/L的聚乙烯吡咯烷酮和體積分數為0.3％的2-巰基乙醇，該濃度為配成后的濃度，即每100mL該洗脫液中含有1M Tris-HCl 10mL、5M NaCl 28mL、0.5M EDTA 4mL、2g聚乙烯吡咯烷酮和30μl 2-巰基乙醇；

所述提取緩沖液為100mmol/L的Tris-HCl，pH 8.0、1.4mol/L的NaCl、20mmol/L的EDTA，pH8.0、質量濃度為20g/L的CTAB、質量濃度為20g/L的的聚乙烯吡咯烷酮和體積分數為0.3％的2-巰基乙醇，即每100mL該提取緩沖液中含有1M Tris-HCl 10mL、5M NaCl28mL、0.5M EDTA 4mL、2g CTAB、2g聚乙烯吡咯烷酮和30μl 2-巰基乙醇。