[發明專利]一種基于MPN與PCR的食品中沙門氏菌快速定量方法

在審

• 申請號: 201710077676.4
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106636437A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 劉道峰;劉成偉;游興勇;周厚德;劉洋
• 申請（專利權）人: 江西省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于檢測領域，涉及沙門氏菌的檢測方法。

背景技術

沙門氏菌分布廣泛，學界共識認為該菌是食品中污染程度最高的一類菌，在世界各地的細菌性食物中毒病例統計中，由沙門氏菌引起的案例數常占首位或次位。迄今為止，世界范圍內已經報道的沙門氏菌血清型大于2600種。沙門氏菌導致的傷寒、副傷寒、發熱等是發展中國家最為常見的疾病，在環境衛生條件較差的地區甚至會導致死亡。有報道顯示，每年全球有大約9400萬例腸胃炎以及15.5萬例死亡病例均是由沙門氏菌導致，其中有85%是食物引起的。

在中國，沙門氏菌對食品安全的污染同樣嚴重，作為首要的食源性致病因素，沙門氏菌導致了近70%~80%的食源性疾病。Yang等結果顯示，在全國范圍內抽檢的539份即食食品中，有19份檢出了沙門氏菌，總檢出率達3.52%，大部分陽性樣本污染程度為0.3~10 MPN/g，部分樣本甚至污染水平高達110 MPN/g。申請人項目組為了解本省（江西省）食品中食源性沙門氏菌污染情況，抽檢本省13類3437份食品，并對分離的沙門菌進行血清型鑒定試驗。結果顯示，所檢3437份食品中檢出受沙門菌污染樣本155份，沙門菌檢出率達4.51%，其中生禽肉、生畜肉中的沙門菌檢出率分別高達27.4%、13.7%，意味著，在我省平均每4份生禽肉樣本就有1份污染了沙門氏菌。綜上所述，沙門氏菌在全國乃至世界范圍內對食品安全構成了嚴重威脅，而我省的污染情況尤為嚴重。

常規的檢測沙門氏菌的方法為培養法，該方法涉及到前增菌、選擇性增菌培養、生化鑒定以及血清分型等后續鑒定步驟。此法雖是目前微生物鑒定和仲裁結果判定的標準方法，但通常需要花費數天的檢測時間，需要特殊的操作環境及繁瑣的步驟，且方法為定性方法，無法實現定量檢測，無法滿足食品安全風險評估等工作對食品樣本中沙門氏菌定量檢測的需要。

另外，也有研究者采用免疫學或者熒光定量的分子生物學手段實現了沙門氏菌的定量檢測，但方法定量均依賴于預設的標準曲線，一旦檢測環境、試劑、操作步驟、檢測樣本等出現改變就會導致定量結果出現偏差。

發明內容

本發明的目的在于提供一種食品及相關樣本中的沙門氏菌攜帶量（污染量）的評估方法。

本發明所提供的方法基于MPN（Most Probable Number，最大或然數）及PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）的技術原理。所述方法不依賴于預設標準曲線，在實現沙門氏菌的定量的前提下又兼具PCR方法的快速、準確的優點。

整個檢測過程可以在兩個工作日內完成，相比傳統基于培養的方法可有效縮短檢測流程、節省工作量；相比其他沙門氏菌定量方法，本法無需建立標準曲線，規避了不同樣本及檢測環境的差異的影響。方法簡便易操作，結果準確，特別適用于食品安全風險評估等工作中對鮮活生冷等食品樣本中沙門氏菌污染劑量或帶菌水平的快速估計。過程見圖1。

技術方案具體如下：

一種基于MPN與PCR的食品中沙門氏菌快速定量方法，包括以下步驟：（1）食品樣本的梯度稀釋；（2）菌的復蘇及增菌培養；（3）DNA的提取；（4）沙門氏菌屬特異性引物PCR擴增及PCR結果檢測；（5）MPN法估計原樣本中沙門氏菌濃度；

食品樣本的梯度稀釋過程包括：稱取25g或25mL食品樣本加入225mL無菌BPW中，拍擊式均質25s或其他方式充分震搖混合，使食品樣本表面或內部可能存在的沙門氏菌散布于BPW中，靜置數秒所得上清液作為1:10樣本稀釋液。吸取1:10稀釋液1 mL，注入含有9 mL BPW的試管內，振搖試管混勻，制備1:100的稀釋液。另取1 mL滅菌吸管，按上條操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管；

菌的復蘇及增菌培養過程包括：根據對檢樣污染情況的估計，選擇三個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度接種3支含有9mL BPW的試管，每管接種1 mL。置36 ℃±1 ℃恒溫箱內，培養8 h～18 h；

DNA的提取過程包括但不限于：分別取上述增菌液1 mL，8000 r/min離心，棄去上清液以去除有機酸等細菌代謝產物對PCR的不利影響，無菌水重懸后采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有機溶劑萃取法提取并純化細菌DNA；