[發(fā)明專利]鯉皰疹病毒3型1301株ORF136基因重組表達(dá)蛋白、抗體及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710076686.6
• 申請(qǐng)日: 2017-02-13
• 公開（公告）號(hào): CN107056898A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王慶;鄭樹城;李瑩瑩;曾偉偉;王英英;劉春;任燕;石存斌;黃琦雯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C07K14/03
• 分類號(hào): C07K14/03;C07K16/08;C07K16/06;C12N15/38;C12N15/70
• 代理公司: 佛山幫專知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44387
• 代理人: 胡麗琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及由鯉皰疹病毒3型1301株ORF136基因重組表達(dá)蛋白、由ORF136重組表達(dá)蛋白制備的多克隆抗體及其應(yīng)用，進(jìn)一步涉及多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)

鯉皰疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3，CyHV-3)，又稱為錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)，是引起鯉魚、錦鯉及其變種高度傳染性錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的病原。該病自從1997年在歐洲發(fā)現(xiàn)以來，多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都報(bào)道了由該疾病引起的鯉魚或錦鯉暴發(fā)性死亡現(xiàn)象，給鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。CyHV-3屬于皰疹病毒目，異皰疹病毒科，鯉皰疹病毒屬，是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒直徑為167～200nm，基因組全長(zhǎng)295kbp，兩端為22kbp的正向重復(fù)序列，共編碼164個(gè)開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，包括8個(gè)重復(fù)ORF，是已知基因組最大的皰疹病毒。

目前，運(yùn)用質(zhì)譜學(xué)的方法已鑒定到46種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。其中，Michel等運(yùn)用液相串聯(lián)色譜技術(shù)在KHV-FL株中鑒定到13種囊膜蛋白、3種核衣殼蛋白、2種皮層蛋白和22種未知蛋白共40種結(jié)構(gòu)蛋白。隨后，Yi等通過對(duì)亞洲型KHV-GZ10和歐洲型KHV-GZ11進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，將鑒定的結(jié)構(gòu)蛋白增加至46種。雖然通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定對(duì)CyHV-3病毒蛋白有了一定的認(rèn)識(shí)，但大部分蛋白的精確定位和功能研究仍處于空白，只有少數(shù)蛋白進(jìn)行了較深入的鑒定，其中，ORF81編碼蛋白是研究較多的結(jié)構(gòu)蛋白之一。另外，F(xiàn)uchs等還對(duì)部分囊膜蛋白ORF25、ORF65、ORF99、ORF136、ORF149和主要衣殼蛋白ORF92進(jìn)行了初步鑒定。

本發(fā)明選擇的ORF136在亞洲型和歐洲型分離株中存在核苷酸序列差異，其完整開放閱讀框長(zhǎng)度分別為474bp和462bp，該基因可作為CyHV-3分子分型的有效工具。雖然蛋白質(zhì)譜分析顯示ORF136編碼蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白，但未見具體的驗(yàn)證，其深入的功能定位還不清楚，更多相關(guān)研究仍有待開展。

雖然目前已有很多CyHV-3的檢測(cè)診斷方法，但在實(shí)際廣泛應(yīng)用中主要還是基于分子的檢測(cè)技術(shù)，血清學(xué)診斷并沒有得到廣泛的應(yīng)用。尤其是對(duì)于潛伏感染的宿主來說，基于分子的檢測(cè)并不能判斷宿主體內(nèi)是否存在病毒，而血清學(xué)診斷技術(shù)能彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。基于免疫學(xué)的抗原檢測(cè)方法的建立，需要有能特異性識(shí)別CyHV-3的抗體。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種鋰皰疹病毒3型1301株ORF136基因重組表達(dá)蛋白及其制備的多克隆抗體，進(jìn)一步提供所述多克隆抗體用于檢測(cè)ORF136基因病毒的應(yīng)用，以及多克隆抗體的制備方法。

為解決上述問題，一方面，本發(fā)明在于提供一種鯉皰疹病毒3型1301株ORF136基因重組表達(dá)蛋白，其全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本發(fā)明在于提供一種編碼鯉皰疹病毒3型1301株ORF136基因重組表達(dá)蛋白的核苷酸，其全長(zhǎng)核苷酸堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

一方面，本發(fā)明提供一種多克隆抗體，其是以氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的重組表達(dá)蛋白為抗原在免疫動(dòng)物中制備所得。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的一部分；其具體制備過程為將鯉皰疹病毒3型1301株ORF136基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到重組克隆載體pMD18-T-ORF136；將重組克隆載體pMD18-T-ORF136、原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-32a-ORF136；將pET-32a-ORF136轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后得到如SEQ ID NO:5所示的重組表達(dá)蛋白。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的多克隆抗體制備過程如下：將如SEQ ID NO:5所示的重組表達(dá)蛋白對(duì)兔子進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，免疫后進(jìn)行采血；將血液靜置后，離心，收集血清，用親和純化的方式對(duì)抗血清進(jìn)行純化，得到多克隆抗體。

另一方面，本發(fā)明在于提供一種本發(fā)明所述的多克隆抗體用于制備檢測(cè)鯉皰疹病毒3型的免疫工具的應(yīng)用。本發(fā)明所述的免疫工具包括但不限于，試劑、試劑盒、芯片或試紙。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的多克隆抗體在檢測(cè)、預(yù)防或治療鯉皰疹病毒3型感染引起的相關(guān)疾病中的應(yīng)用。