[發明專利]豬肌抑素基因編輯位點864-883及其應用

有效

• 申請號: 201710076191.3
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106754949B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 畢延震;劉西梅;鄭新民;李奎;任紅艷;唐中林;張立蘋;陳建武;華文君;華再東;李莉;肖紅衛
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

技術領域

本發明屬于生物技術和生物工程領域，具體涉及豬肌抑素基因編輯位點及其應用。

背景技術

基因轉移技術根據外源基因整合的位點特異性可分為兩大類，一類是非定點的，即導入的外源基因在靶細胞基因組中整合的位點一般是隨機的，包括顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀、逆轉錄病毒載體感染等：另一類則是定點的，即外源基因導入靶細胞后整合到預先確定的位點或對細胞內靶位點進行定點修飾，這就是依賴于同源重組的基因打靶技術。將外源基因精準敲入豬體細胞的基因組中，一直都是極為困難的，因為早期僅基于同源重組的基因打靶技術效率極低，應用受到很大的限制。直到近年來人工核酸內切酶(engineered endonuclease,EEN)的出現，才徹底改變了這一現狀。

鋅指核酸內切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)是第一代人工核酸內切酶。鋅指是一類能夠結合DNA的蛋白質，很多轉錄因子中都含有鋅指結構。ZFN是將鋅指蛋白的DNA結構域和FokI核酸內切酶中的非特異性的DNA切割結構域組合形成的一種嵌合體蛋白，其既具有鋅指蛋白結合DNA的能力又具有核酸內切酶FokI切割DNA雙鏈的能力(Kim Y G,Cha J,Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokI cleavage domain.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(3):1156-1160.)。利用ZFN可以在各種復雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。到目前為止，ZFN已經成功應用于豬、牛、大鼠、小鼠、斑馬魚、家蠶、果蠅、海膽、擬南芥、煙草、玉米等生物(Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases.Nat Rev Genet,2010,11(9):636-646.)。但是，由于ZFN制備流程復雜，成本昂貴，而且其技術專利被少數幾家商業公司所控制，所以推廣應用十分有限。

2009年，科學家將一種水稻的致病菌(Xanthamonas)編碼的類轉錄激活因子效應物(transcription activator-like effector,TALE)與DNA的堿基對應關系解密(Moscou M J,Bogdanove A J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science,2009,326(5959):1501；Boch J,Scholze H,Schornack S,et al.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.Science,2009，326(5959):1509-1512.)。第二代人工核酸酶——類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)應運而生。和ZFN相似，TALEN主要由TALE蛋白的DNA結合結構域和Fok I核酸內切酶結構域組合而成，TALE蛋白含有多個33-35個氨基酸組成的重復肽段，而每一個肽段都能夠識別一個堿基。2010年，首次報道TALEN蛋白在酵母中應用成功(Li T,Huang S,Zhao X,et al.Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic acids Res,2011,39(14):6315-6325.)。之后，TALEN在植物、小鼠、斑馬魚、豬、牛等動植物中得到了迅速的推廣與應用(Joung J K,Sander J D.TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):49-55.)。TALEN不僅可以像ZFN一樣對復雜的基因組進行精細的修飾，而且其構建更加簡單，特異性也更高，因此TALEN出現不久就在很大程度上替代了ZFN。2012年，TALEN被《科學》(Science)雜志評為十大科學突破之一(Breakthrough of the year.The runners-up.Science,2012,338(6114):1525-1532.)。