[發明專利]孢子絲菌DRK1基因GFP報告菌株的構建方法

在審

• 申請號: 201710075772.5
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106906239A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 張振穎;侯彬彬
• 申請（專利權）人: 香港大學深圳醫院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65;C12N15/54;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明屬于真菌報告菌株構建領域。具體涉及孢子絲菌DRK1基因啟動子的獲得、DRK1基因終止子的獲得、重組載體PCB309-PGFPT的構建、用于轉染的根癌農桿菌及孢子絲菌。

背景技術

孢子絲菌病是由申克孢子絲菌及其復合體引起的皮膚、皮下組織及附近淋巴管的慢性感染性疾病，是最常見的皮膚深部真菌病。隨著寵物飼養及免疫受損人群數量的增多，本病的發病率不斷攀升，并出現局部區域的爆發流行。孢子絲菌病在全球范圍內廣泛分布，我國為該病的高發地區，2008-2013年間僅一家醫院就接診孢子絲菌病患者1500余例，嚴重危害民眾健康。

孢子絲菌屬于雙相病原真菌，此類真菌在自然環境中呈腐生狀態生長，無致病性，入侵宿主后其生存環境發生驟變，菌體為適應變化的溫度，碳源，偏酸或中性的PH值以及缺氧、高二氧化碳的生存環境不得不發生形態轉換，轉呈寄生狀態生長，并形成致病性。大量研究證實處于信號轉導通路上游位置的雙組分信號系統在雙相真菌適應體內的高滲透壓及氧化刺激、形態轉化、細胞壁生物合成以及毒力、致病性形成等方面發揮重要作用。雙組分信號系統廣泛存在于莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌、馬內菲青霉菌、白念珠菌等多種病原真菌體內，而人類細胞中尚未發現該信號轉導系統的存在，因此，探明真菌雙組分信號轉導系統的機制可為抑制物的設計和尋找提供多個靶點，針對這些靶點研發的新型抗真菌藥物將有效地抑制病原真菌的生長而不對宿主細胞造成損傷。近年，病原真菌雙組份信號轉導系統中組氨酸蛋白基因受到了學者的廣泛關注，白念珠菌組氨酸蛋白激酶CaHK1/CaNIK1/CaCOS1/CaSLN1、粗糙脈胞霉菌組氨酸蛋白激酶NIK-1、皮炎芽生菌組氨酸蛋白酶DRK1、莢膜組織胞漿菌組氨酸蛋白酶DRK1相繼被鑒定出來，并被證實為調控真菌致病性的形成及毒力蛋白表達的關鍵基因。

與其他雙相真菌病相比，孢子絲菌病發病率最高，病原菌的毒力相對較弱，具有很好的實驗安全性，并因大多僅感染皮膚和皮下組織而便于觀察的特點可望成為雙相真菌病防治研究的突破點。先前研究已經證實孢子絲菌雙組份信號系統組氨酸蛋白激酶DRK1基因的存在，并對其進行克隆、結構功能域預測及致病性的鑒定。所以對其功能進行更深入的研究、并以其為靶點開發嶄新的抗真菌藥物及治療方法，具有嶄新的意義。

發明內容

本發明的目的是構建一種孢子絲菌DRK1基因GFP報告菌株，以綠色熒光蛋白表達情況來示蹤DRK1的表達水平，從而對DRK1基因的表達做到更加便捷、準確的監測。

本發明采用的技術方案是：孢子絲菌DRK1基因GFP報告菌株的構建方法，包括如下步驟：

(一)提取孢子絲菌總DNA；

(二)克隆孢子絲菌SsDRK1基因加尾信號序列至p-EGFP-N1載體的gfp基因尾部，制備重組質粒p-EGFP-N1-t：

2.1)以DNA為模板，以特異性引物Au和Ad進行PCR擴增，擴增具有孢子絲菌SsDRK1基因加尾信號序列的PCR產物；

所述的特異性引物Au：gcggcggccgcTAGGGACAAGGACCTCCAC

所述的特異性引物Ad：gcgtctagactagtGTAGTAAACAATCAAAACCAGTG

所述的孢子絲菌SsDRK1基因加尾信號序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2.2)將PCR產物和p-EGFP-N1載體分別用NotI和XbaI雙酶切，將酶切回收的PCR產物和p-EGFP-N1連接；

2.3)將連接產物轉化大腸桿菌DH5a，獲得重組質粒p-EGFP-N1-t；

(三)克隆孢子絲菌SsDRK1基因啟動子序列至重組質粒p-EGFP-N1-t的gfp基因前部，制備重組質粒p-EGFP-N1-p-t：

3.1)以DNA為模板，以特異性引物Qu和Qd進行PCR擴增，擴增具有孢子絲菌SsDRK1基因啟動子序列的PCR產物；

所述的特異性引物Qu：gcggagctcGCGAATGGACAGAGGTAAGT

所述的特異性引物Qd：gcgggatccTGTTGAAAGAGGGTAAACGGAG

所述的孢子絲菌SsDRK1基因啟動子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3.2)將PCR產物和p-EGFP-N1-t分別用SacI和BamHI雙酶切，將酶切回收的PCR產物和p-EGFP-N1-t連接；