[發(fā)明專利]結(jié)核分枝桿菌Rv0189c重組蛋白、制備方法及其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710075322.6
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106699853A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王森;張文宏;張穎
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 竺路玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬診結(jié)核病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核分枝桿菌Rv0189c重組蛋白、制備方法及其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)核病是當(dāng)今全球面臨的主要公共健康問題之一，它的病原體是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，屬分枝桿菌屬。近年來，由于耐藥結(jié)核病、人類免疫缺陷病毒(HIV)合并結(jié)核分枝桿菌感染、大規(guī)模人口流動等問題的出現(xiàn)，結(jié)核病疫情出現(xiàn)加重的趨勢。目前，全球每年約有900萬人發(fā)展成活動性結(jié)核，200萬～300萬人死于結(jié)核病。據(jù)估計，目前全世界約有1/3的人口感染了Mtb，其中絕大多數(shù)為潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)，即機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠控制結(jié)核桿菌的復(fù)制而不發(fā)展成為結(jié)核病，但又不能將其徹底清除的狀態(tài)。此時結(jié)核桿菌處于潛伏狀態(tài)，在在免疫力低下者中，結(jié)核桿菌能夠重新復(fù)制，發(fā)展成為活動性肺結(jié)核從而成為新的傳染源。感染者終生約有5％～10％的風(fēng)險發(fā)展成為活動性結(jié)核病，若同時伴有HIV的感染，這種概率則高達(dá)每年10％，遠(yuǎn)高于HIV陰性者。流行病學(xué)調(diào)查顯示約有85％～90％新診斷的活動性肺結(jié)核系結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性的LTBI演變而來。因此，對LTBI者的進(jìn)行早期診斷和預(yù)防性治療，既能夠減少已感染結(jié)核桿菌者的發(fā)病機(jī)會，又可以通過影響發(fā)病，來減少結(jié)核桿菌在人群中的傳播。

為了控制結(jié)核病的疫情，急需有效地診斷方法來診斷活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染。目前結(jié)核病確診的主要依據(jù)依然是細(xì)菌學(xué)檢查(包括培養(yǎng)和涂片)。但結(jié)核桿菌的培養(yǎng)需要很長的時間(6～8周)，不利于臨床結(jié)核病的診斷和治療；痰涂片法雖然簡便、快速，但是敏感性很低，平均檢出率只有25％～35％。此外，對于肺外結(jié)核(如骨關(guān)節(jié)結(jié)核、淋巴結(jié)核等)細(xì)菌學(xué)檢查陽性率普遍偏低，有時還存在取樣的困難。潛伏性結(jié)核感染的特點(diǎn)決定了其無法被細(xì)菌學(xué)方法檢出。目前診斷LTBI應(yīng)用最為廣泛的方法仍是結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)，TST所使用的抗原PPD，是從結(jié)核分枝桿菌粗提的抗原混合物，其中有200多種抗原成分與卡介苗(BCG)和非結(jié)核分枝桿菌的抗原成分相同，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，使TST方法出現(xiàn)了較高的假陽性率，診斷的特異性較低。此外，TST對于近期免疫受抑制的病人特別是合并HIV感染、重癥疾病者、年幼兒童及營養(yǎng)不良者，缺乏足夠的靈敏度。

自1976年Hassau等建立用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測抗結(jié)核分支桿菌抗體的方法以來，結(jié)核病的血清學(xué)診斷方法得到飛速發(fā)展，技術(shù)日益成熟，并得到了越來越廣泛的應(yīng)用。血清學(xué)診斷具有快速、簡便、低廉且不需要活細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。這些年來，在血清學(xué)診斷抗原方面的研究已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，確認(rèn)了幾個很有希望的血清學(xué)抗原，如38kDa,Lipoarabinomannan(LAM)，16kDa(Rv2031c),MTB81(Rv1837c),ESAT-6(Rv3875),Antigen 85B(Rv1886c),Antigen60以及選取不同蛋白的融合蛋白等.目前已有數(shù)種商品化的結(jié)核血清學(xué)診斷試劑盒，包括應(yīng)用結(jié)核抗原Antigen 60的Anda-TB檢測(Anda Biologicals，Strasbourg,France)，應(yīng)用LAM及38kDa抗原的Pathozyme Myco及應(yīng)用38kDa和16kD抗原的Pathozyme TB Complex Plus(Omega Diganostics,Allo,Scotland,UK)及應(yīng)用LAM抗原的MycoDot(Blackstone,Massachusetts,USA)。對現(xiàn)有商品化試劑盒的meta分析表明,無論是在肺結(jié)核還是肺結(jié)核的診斷中，現(xiàn)有的商品化血清學(xué)檢測方法均未達(dá)到理想的診斷效果。因此，發(fā)現(xiàn)新的血清學(xué)診斷抗原標(biāo)志物，并建立新的結(jié)核病免疫診斷方法是結(jié)核病診斷所急需的。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服目前結(jié)核桿菌免疫診斷方面存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌Rv0189c重組蛋白及其制備方法，將其應(yīng)用于結(jié)核病的診斷，使得診斷具備較高的敏感性和特異性，并且更為快速和安全。

本發(fā)明提供一種結(jié)核分枝桿菌Rv0189c重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明所述的Rv0189c蛋白能夠制備診斷試劑，用于結(jié)核病的免疫檢測。

本發(fā)明中所述的蛋白除了通常所指的一種氨基酸聚合物，還應(yīng)該包括其類似物如多肽。多肽可與上述蛋白序列同源，這個類似物能夠與蛋白同樣結(jié)合到相同的抗體分子上，且類似物中處于等價位置上的氨基酸與原始肽中的那些抗原序列相同或保守。