[發(fā)明專利]利用淀粉樣蛋白Aβ25?35制備人視網(wǎng)膜上皮細胞(ARPE)毒性模型的方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710075104.2
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106834231A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉子;李朝輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12Q1/02
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 馮慧云

1.一種利用淀粉樣蛋白Aβ25-35制備人視網(wǎng)膜上皮細胞(ARPE)毒性模型的方法，包括以下步驟：

a、將淀粉樣蛋白Aβ25-35用細胞培養(yǎng)基制備成寡聚體；

b、接種ARPE細胞并培養(yǎng)；

c、按照Aβ25-35寡聚體不同濃度處理ARPE細胞；

d、在Aβ25-35寡聚體處理ARPE細胞48-60h后，按照常規(guī)的MTT方法進行檢測，篩選Aβ25-35寡聚體對ARPE細胞毒性的最優(yōu)濃度條件。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中包括：

a1：于無菌條件下將Aβ25-35蛋白按照1mg加0.36ml溶劑的比例溶解，配成濃度為1mmol/L-10mmol/L的Aβ25-35儲存液；

a2：將Aβ25-35儲存液置于二氧化碳培養(yǎng)箱中35℃-39℃孵育，使其老化以獲得Aβ寡聚體；每天1次將Aβ25-35儲存液顛倒混勻；3-7天后將Aβ25-35儲存液從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，保存于4℃或者直接使用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中包括：

b1：取處于增殖期的APRE細胞，用PRMI1640完全培養(yǎng)基配成單細胞懸液，接種到96孔細胞培養(yǎng)板，調(diào)整細胞最終接種密度為10％-20％，每孔體積100μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中包括：

c1：待接種細胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度Aβ25-35儲存液(0μmol/L，0.3μmol/L，1.0μmol/L，5.0μmol/L，20μmol/L，60μmol/L)的PRMI1640完全培養(yǎng)基；每2d換液1次。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟a1中的溶劑采用PRMI1640培養(yǎng)基或無菌超純水。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟a1中Aβ25-35儲存液的濃度為2.5mmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟a2中孵育溫度為37℃，5天后將Aβ25-35儲存液從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟b1中，所述細胞最終接種密度為15％。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d中，淀粉樣蛋白Aβ25-35對ARPE細胞毒性的最優(yōu)濃度條件為60μmol/L。

10.權(quán)利要求1-8任一項所述的方法獲得的細胞毒性模型在針對體外研究Aβ蛋白對年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的影響、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)發(fā)生的誘發(fā)因素及其分子調(diào)控機理中的應(yīng)用。