[發(fā)明專利]一種催化合成左旋肉堿的生物酶及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710074782.7
• 申請日: 2017-02-12
• 公開（公告）號: CN106947752A
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祝俊;劉家生;吳鋒;余玉奎;沈?yàn)闃?biāo);徐飛
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇誠信藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N9/54;C12P13/00;C12R1/19;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種合成左旋肉堿的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和現(xiàn)代化的分離技術(shù)的左旋肉堿合成方法，具體是一種催化合成左旋肉堿的生物酶及其制備方法。

背景技術(shù)

左旋肉堿 (L-carnitine)，又稱L-肉堿或音譯卡尼丁，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸，紅色肉類是左旋肉堿的主要來源，對人體無毒副作用。左旋肉堿是脂肪代謝過程中的一種關(guān)鍵的物質(zhì)，能夠促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化分解。左旋肉堿的主要生理功能是促進(jìn) 脂肪轉(zhuǎn)化成能量，服用左旋肉堿能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時(shí)，不減少水分和肌肉，在2003年被國際肥胖健康組織認(rèn)定為最安全無副作用的減肥營養(yǎng)補(bǔ)充品。

左旋肉堿的制取方法

1.直接提取法

由以上表可以看出．在動物肌肉中左旋肉堿的含量相對較豐富，早期的左旋肉堿往往是從肉浸汁中分離出來但由于左旋肉堿的絕對含量較少，且有結(jié)構(gòu)類似物(肉浸汁中的膽堿)存在，難以分離，因而提取純化的步驟較多，收率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2．消旋體拆分法

化學(xué)拆分

美國專利3151149報(bào)道了使用D-(+)-樟腦-10-磺酸進(jìn)行拆分，但此方法要使用AgNO₃以除去Cl^-，因而成本高，收率低(小于50％)，純度低，生產(chǎn)條件苛刻。左旋肉堿比較經(jīng)典的化學(xué)拆分法是先合成肉堿消旋體然后再進(jìn)行拆分。以環(huán)氧氯丙烷為起始原料，經(jīng)胺化、腈化、水解而得到肉堿消旋體。此法的優(yōu)點(diǎn)是避開了有毒的氰化物等有毒物質(zhì)，且無需離子交換樹脂，操作簡單安全，但合成步驟多、收率不高。

生物拆分

利用微生物專一降解右旋肉堿的能力生產(chǎn)左旋肉堿。Charles在此方面作了很多工作．選育出降解右旋肉堿有特效的菌株，經(jīng)過25℃，44h的培養(yǎng)，右旋肉堿全部消失，左旋肉堿剩下38%，由此可見，盡管純度很高，但收率太低。

3．不對稱催化合成法

用催化劑的不對稱中心來誘導(dǎo)產(chǎn)生物的手性。這是指只合成光學(xué)異構(gòu)體中的一個(gè)方法。Kitamura等人通過不對稱催化氫化γ一氯一乙酰乙酸酯合成出制各左旋肉堿的重要中間體γ-氯-β-羥基丁酸酯。反應(yīng)得到中間體的光學(xué)純度為97%，這種方法簡便。快捷，純度高，但反應(yīng)條件苛刻。Mccarthy發(fā)明了一種簡單的方法，就是以(S)-3-羥基丁酸內(nèi)酯為原料，經(jīng)過兩步反應(yīng)，直接得到左旋肉堿，光學(xué)純度高達(dá)95%。

4．生物化學(xué)法。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了解決以上問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種催化合成L-左旋肉堿的生物酶。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述催化合成左旋肉堿的生物酶的核苷酸序列。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種催化合成左旋肉堿的生物酶的發(fā)酵方法。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供從發(fā)酵液中制備催化合成L-左旋肉堿的生物酶的提取方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種催化合成左旋肉堿的生物酶，所述生物酶為SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明所述催化合成左旋肉堿的生物酶，所述生物酶來源于體外重組構(gòu)建的基因工程菌株。

根據(jù)本發(fā)明所述催化合成左旋肉堿的生物酶，所述基因工程菌株為大腸桿菌、畢氏酵母、枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明還提供一種編碼所述的催化合成左旋肉堿的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明還提供一種所述的催化合成左旋肉堿的生物酶的制備方法，包括如下步驟：

（1）首先構(gòu)建L-左旋肉堿的基因工程菌株，將權(quán)利要求3所述的核苷酸序列經(jīng)酶切重組到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；

（2）將陽性克隆挑入LB液體培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)酵，得到含有催化合成L-左旋肉堿的生物酶。

本發(fā)明所述的催化合成左旋肉堿的生物酶提取方法，包括如下步驟：

（1）取原種菌種在斜面培養(yǎng)基劃線，37℃，倒置培養(yǎng)16h。

（2）在斜面上挑取2環(huán)菌種至5ml種子培養(yǎng)基（50ml試管）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，制備一級種子液。

（3）試管菌種轉(zhuǎn)接至200ml培養(yǎng)基（500酶量三角瓶）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，制備二級種子液。