[發明專利]一種復合誘導培養基以及采用該培養基誘導臍帶間充質干細胞成神經元樣細胞的方法

有效

• 申請號: 201710074106.X
• 申請日: 2017-02-10
• 公開（公告）號: CN107058225B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 關方霞;馬珊珊;邢衢;王欣欣;黃團結;孟楠;楊波
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0775
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙) 41114
• 代理人: 王霞

本發明公開了一種復合誘導培養基，包括DA、DB、DC三種分化培養液，采用該復合誘導培養基誘導臍帶間充質干細胞成神經元樣細胞的方法是：首先采用DA分化培養液對臍帶間充質干細胞預誘導2天；然后采用DB分化培養液分化誘導1天；最后采用DC分化培養液維持誘導1天；觀察誘導后的神經元樣細胞形態特征，檢測誘導后神經分化相關基因mRNA水平，檢測誘導神經元樣細胞神經元遷移蛋白DCX、神經元特異性烯醇化酶NSE表達情況：DCX表達陽性者為神經前體細胞,NSE表達陽性者為神經元樣細胞。本發明將誘導過程分為三階段，每階段誘導時采用不同的培養基，誘導時間短，誘導效率高，誘導分化的神經元樣細胞存活穩定，移植后無排斥。

技術領域

本發明涉及干細胞神經分化技術，尤其是涉及一種復合誘導培養基，本發明還涉及采用該培養基誘導臍帶間充質干細胞成有較高存活水平的神經元樣細胞的方法。

背景技術

臨床上，中樞神經系統損傷會導致腦、脊部神經細胞大量死亡，神經功能永久缺失，且很難自我修復。鑒于目前快速提取神經干細胞仍未有穩定的解決方案，因此對其他來源的干細胞進行誘導以獲取數目穩定、功能完備的神經元樣細胞的策略被科學界寄予厚望。

較其他來源干細胞，臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cell, HUCMSC)具有采集痛苦小、自我更新快、增殖能力強、無免疫排斥、無倫理爭議等特點。如何高效定向誘導HUCMSC成神經元樣細胞，對于神經環路、突觸連接的重塑和恢復有巨大的臨床應用價值。

細胞分化是一種動態、可逆的程序性重調，合適的誘導微環境可促進成神經分化基因有序表達，啟動相關通路，導致MSC跨系分化。現有神經分化策略主要包括：抗氧化劑誘導、生長因子誘導、中藥誘導、細胞共培養誘導等方案。常用的分化方案雖能誘導神經元樣細胞產生，但仍有不足：（1）經典的高濃度抗氧化劑，雖可短時間內通過細胞骨架結構肌動蛋白斷裂、收縮導致MSC呈現錐樣末端膨大等特征，但亦伴隨著細胞存活數目少、效率有限、有致癌轉化風險等諸多問題，這與誘導組分作用濃度、時間和固有細胞毒性關系緊密；學者Hofstetter發現，MSCs經5 mM β-ME誘導48小時后膜片鉗電生理檢測結果顯示出誘導的神經元樣細胞沒有表達鈉、鉀電壓門控通道，不產生動作電位，屬不成熟的神經元。（2）單一應用細胞因子可通過靶源性改善神經營養因子供給重建軸突，提高神經元樣細胞存活，但誘導時間長、效率低。（3）學者姚曉黎認為，部分中藥誘導MSC分化過程存在逆轉化現象，誘導時間仍需摸索。（4）細胞共培養方案對實驗操作人員技術和環境要求高，后期細胞移植仍需流式篩選分離。因此，組分合理的誘導策略是決定轉歸效率的關鍵因素。

發明內容

本發明的目的是針對現有誘導組分或誘導策略存在的不足，提供一種組分合理、高效穩定的復合誘導培養基，本發明還提供采用該培養基在較短時間內將臍帶間充質干細胞誘導成存活水平較高的神經元樣細胞的方法。

為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：

本發明所述的復合誘導培養基，包括DA、DB、DC三種分化培養液，所述DA、DB、DC三種分化培養液的配制方法分別為：

DA分化培養液是由每1000ml DMEM-LG培養基中添加40ml FBS和10μg bFGF組成，其中bFGF的終濃度達10 ng/ml；