[發明專利]珍稀水生生物水樣環境DNA優化?養殖水樣預檢測方法

在審

• 申請號: 201710072306.1
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106868117A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 姜維;王啟軍;趙虎;張紅星;鄧捷;孔飛
• 申請（專利權）人: 陜西省動物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，所述珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法在進行水生物種野外分布流域水樣分析前，首先進行養殖水樣預檢測；通過使用養殖水樣，對eDNA分析流程進行優化和標準化；進一步通過對目標物種的水樣eDNA分析流程的各個環節的逐一篩選和優化，實現目標物種水樣eDNA的流程標準化；為水生物種分布調查提供水樣eDNA分析方法。

2.如權利要求1所述的珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，所述進一步通過對目標物種的水樣eDNA分析流程的各個環節的逐一篩選和優化中，對目標物種的水樣eDNA分析流程的各個環節的逐一篩選包括水樣采集方法的篩選、水樣采集量的比對、水樣eDNA提取方法的比較和篩選；

對目標物種的水樣eDNA分析流程的優化包括：水樣eDNA分析的PCR反應體系和水樣eDNA分析的PCR反應流程的反復優化。

3.如權利要求1所述的珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，所述珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法具體包括以下步驟：

在棲息地周邊建設物種養殖池塘；

養殖水樣采集：利用無菌水樣過濾裝置，使用0.45μm孔徑WCN硝酸纖維膜濾膜過濾養殖池水樣，將濾膜取出，儲存于95％的無水乙醇中，帶回實驗室，-20℃保存備用；

水樣采集量：設計梯度水樣采集量；

水樣eDNA提取：將濾膜等分為兩份，分別使用兩種試劑盒提取水樣eDNA；

物種特異性PCR引物設計及篩選：使用Primer premier 5.0軟件設計引物；以物種組織樣DNA為模板，篩選引物及選擇退火溫度48℃～60℃；

PCR反應體系和反應程序優化：eDNA的PCR反應體系為10μL～40μL，每個樣品重復擴增3次～10次；篩選和優化適宜的反應體系和反應程序；

確定水樣eDNA分析流程。

4.如權利要求3所述的珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，在棲息地周邊建設的物種養殖池塘包括：

養殖用水使用井水或無目標物種分布的水流；

養殖密度與物種種群分布密度相當；

進水口流速與出水口流速與物種分布流域的水流速度相當。

5.如權利要求3所述的珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，所述設計梯度水樣采集量中，水樣采集量范圍為1L～2L。

6.如權利要求3所述的珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，PCR反應體系和反應程序優化中，水樣eDNA模板使用量為1μL-10μL，PCR反應程序參照各Taq酶的使用說明進行。

7.如權利要求3所述的珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法，其特征在于，確定水樣eDNA分析流程具體包括：

采集與目標物種分布流域理化性質相似的水樣；

進行適宜的水樣采集方法；

確定最佳的水樣采集量；

建立適宜的水樣eDNA提取方法；

選擇物種特異性的PCR引物和最佳的引物退火溫度；

確定高效的PCR反應體系和反應程序。

8.一種利用權利要求1所述珍稀水生生物水樣環境DNA優化-養殖水樣預檢測方法的水樣預檢測系統。