[發明專利]一種草魚出血病毒的檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201710071985.0
• 申請日: 2017-02-09
• 公開（公告）號: CN108411031A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 張金;朱馨蕾
• 申請（專利權）人: 轉導精進（武漢）生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪

1.一種用于草魚出血病毒VP5基因序列擴增的引物對，其特征在于，所述引物對包括上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R，所述上游引物VP5-Ⅱ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物VP5-Ⅱ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一種草魚出血病毒VP5基因序列的擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）生物信息學方法設計引物組及進行引物篩選得到如權利要求1所述的引物對；

2）草魚出血病毒VP5基因的熒光定量PCR檢測：用病毒RNA提取試劑盒提取草魚出血病毒基因組RNA；

3）以步驟2）的草魚出血病毒基因組RNA樣本為模板，將權利要求1所述的引物對進行一步法熒光定量RT-PCR獲得PCR擴增產物；

4）步驟3）得到的PCR擴增產物分析并測序獲得草魚出血病毒VP5基因序列。

3.根據權利要求2所述的一種草魚出血病毒VP5基因序列的擴增方法，其特征在于，所述步驟1）是通過熒光定量RT-PCR進行引物PCR擴增效率檢測從而篩選得到權利要求1所述的引物對。

4.一種草魚出血病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述草魚出血病毒的檢測試劑盒包括權利要求1所述的引物對。

5.根據權利要求4所述的草魚出血病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R的摩爾濃度比是1.5：1。

6.根據權利要求4所述的草魚出血病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒包括：

1）草魚出血病毒反應液、Taq DNA聚合酶和反轉錄酶：草魚出血病毒反應液包括含有dNTPs、10×buffer、MgC1₂、SYBR green I、DEPC水及權利要求1所述的引物對的混合液；

2）陽性對照物：

3）臨界陽性對照物；

4）陰性對照物。

7.根據權利要求4所述的草魚出血病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性對照物是含有高純度草魚出血病毒提取的總RNA。

8.權利要求4~7任一項所述的草魚出血病毒的檢測試劑盒在魚類致病菌的檢測方面的應用。

9.權利要求4~7任一項所述的草魚出血病毒的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法是將RNA反轉錄和熒光定量PCR反應在同一個反應管內連續進行。

10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法具體包括以下步驟：

1）提取魚樣組織的RNA得到樣品RNA；

2）建立一步法熒光定量RT-PCR反應體系；

3）通過比對標準品實時熒光定量RT-PCR擴增曲線確定是否感染草魚出血病毒。