[發明專利]一種瓜類細菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測試紙及其應用

在審

• 申請號: 201710071839.8
• 申請日: 2017-02-09
• 公開（公告）號: CN106872696A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 曾海娟;劉箐
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種微生物的檢測方法，具體來說是一種瓜類細菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測試紙及其應用。

背景技術

瓜類果斑病是一種嚴重的細菌性病害，20世紀80年代后期該病因在美國數個州的西瓜上出現破壞性爆發而受到廣泛關注，自此，瓜類細菌性果斑病在世界范圍內傳播開來。其病原為革蘭氏陰性菌的嗜酸菌屬燕麥種西瓜亞種(Acidovorax citrulli,Ac)，是一種具有高度破壞性的種傳病菌。該病菌的抗干旱能力非常強，可在干燥的種子表面存活35年。到目前為止，并無完全抵抗該病菌的商業化的培育品種。

瓜類果斑病菌又稱果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科植物患病，據報道，在番茄、茄子等茄科植物的種子中也檢測到了該病原菌，它可侵染果實、植株及種子，主要依靠帶菌種子傳播。帶菌種子播種后會使幼苗患病，出現褐色壞死斑。帶菌果實在采后貯藏運輸過程中會感染健康果實，表面會出現水漬狀斑點，最終導致整個果實腐爛，嚴重影響瓜類產量。

目前市場上用于檢測果斑病菌的試紙是來自美國Agdia公司的免疫膠體金試紙，國內嚴重依賴進口，且現有技術中的免疫膠體金試紙的檢測效果取決于抗體與膠體金的結合效果及金標抗體與檢測抗體的配對情況。目前報道的試紙多為單克隆抗體作為金標抗體和多克隆抗體作為檢測抗體配合使用，因此存在著檢測靈敏度低、交叉反應多、試紙條有效期短等問題，對檢測準確度造成了一些不利影響。

發明內容

針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種瓜類細菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測試紙及其應用，所述的這種瓜類細菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測試紙及其應用要解決現有技術中的檢測瓜類細菌性果斑病菌的試紙靈敏度低、交叉反應多、試紙條有效期短的技術問題。

本發明提供了一種瓜類細菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測試紙，包括一個支撐層，所述的支撐層上設置有樣品墊、吸水墊，所述的樣品墊和所述的吸水墊之間設置有硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜的一端和所述的樣品墊的一側緊密連接，所述的硝酸纖維素膜的另外一端和所述的吸水墊的一側緊密連接，所述的硝酸纖維素膜上設置有檢查線，其特征在于：所述的檢測線由保藏號為CGMCC No.10413的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體構成，所述的單克隆抗體的濃度為2mg/mL。

進一步的，所述的支撐層位PVC底板。

進一步的，所述的吸水墊為吸水紙。

采用上述的試紙檢測瓜類細菌性果斑病菌的方法，將待檢測細菌放置于異硫氰酸熒光素改良培養基中過夜培養獲得菌懸液，所述的異硫氰酸熒光素改良培養基由異硫氰酸熒光素和腦心浸液培養基組成，所述的異硫氰酸熒光素在異硫氰酸熒光素改良培養基中的濃度為20μg/mL，將菌懸液采用無菌生理鹽水調到10⁶～10⁸CFU/mL，然后將含有待檢測細菌的菌懸液滴加至樣品墊上，隨著待檢測細菌的流動，如果檢測線的顏色變為黃色，則表示待檢測樣品中含有瓜類細菌性果斑病菌，若檢測線不變色，則代表樣品中無瓜類細菌性果斑病菌。

本發明采用添加FITC的改良腦心浸液(BHI)培養基培養細菌，該方式培養的細菌可以發出黃綠色的熒光，從而使細菌成為熒光探針。由保藏號為CGMCC No.10413的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體6D作為檢測抗體，噴涂于NC膜上形成檢測線，本發明僅需一株抗果斑病菌的單克隆抗體6D作為檢測抗體噴涂于NC膜，并制成無標記的單線免疫熒光試紙，整個制備過程無需標記抗體，避免了標記效果對檢測結果的影響。實驗表明此熒光檢測試紙可檢出大多數的果斑病菌且無交叉反應，具有靈敏度高、準確性好等特點。

本發明的一種雜交瘤細胞株，分類命名：抗瓜類細菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli i)雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2015年3月19日，保藏號為CGMCC NO.10413。

本發明采用的保藏號為CGMCC No.10413的雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體的全部內容在2015年10月21日公開的申請號為“201510420442.6”、發明名稱為“果斑病菌免疫膠體金檢測試紙條及其單抗和雜交瘤細胞株”中的文件中均有記載，在此不再贅述。