[發明專利]一種土壤蛋白質的提取方法在審
| 申請號: | 201710068838.8 | 申請日: | 2017-02-08 |
| 公開(公告)號: | CN106632582A | 公開(公告)日: | 2017-05-10 |
| 發明(設計)人: | 李乃薈;吳鳳芝;陳宇飛;周新剛;劉守偉;潘凱 | 申請(專利權)人: | 東北農業大學 |
| 主分類號: | C07K1/14 | 分類號: | C07K1/14;C07K1/30 |
| 代理公司: | 北京紀凱知識產權代理有限公司11245 | 代理人: | 關暢,吳愛琴 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 土壤 蛋白質 提取 方法 | ||
技術領域
本發明涉及一種土壤蛋白質的提取方法。
背景技術
環境宏蛋白質組學是近年來興起的一種研究技術,該技術可以將土壤中復雜的微生物群體有效的進行綜合分析,以揭示土壤生態系統中的變化。
土壤環境中宏蛋白質組學的研究問題的關鍵在于,土壤蛋白質的提取和分析,其中蛋白質的提取是研究土壤環境的重點。土壤蛋白質的提取是土壤蛋白質組學研究的前提,然而由于土壤蛋白質提取方法的缺乏,當前土壤蛋白質組學的研究還不能有效的開展。因此,本發明針對土壤宏蛋白質提取方面的關鍵技術進行優化,以期本發明能在土壤宏蛋白質組學研究中做出一定貢獻。
發明內容
本發明的目的是提供一種有效的土壤蛋白質的提取方法。
本發明所提供的土壤蛋白質的提取方法,包括下述步驟:
1)向土壤樣品中加入土壤蛋白質提取緩沖液,震蕩,靜置;
2)置于沸水中加熱,于0℃冰水中冷卻,震蕩,離心;
3)將上清液過濾,向已過濾的上清液中加入Tris飽和酚,震蕩,離心,棄去上清液,收集下層苯酚溶液;
4)向下層苯酚溶液中加入甲醇醋酸銨溶液,-20℃放置6h-8h;
5)離心,將上清液移出,收集蛋白質沉淀,將蛋白質沉淀用丙酮清洗,凍干,得到蛋白質干粉。
上述方法步驟1)中,所述土壤蛋白質提取緩沖液為中性的蛋白質提取緩沖液,具體可為pH6.8的蛋白質提取緩沖液。
所述pH6.8的蛋白質提取緩沖液的配制方法為:稱取十二烷基硫酸鈉(SDS)1.25g,三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.2114g,NaCl 0.8766g,二硫蘇糖醇(DTT)0.386g,加入70ml雙蒸水溶解,使用濃鹽酸調節pH至pH 6.8,最后使用雙蒸水定容至100ml,即可。
所述土壤樣品與土壤蛋白質提取緩沖液的配比為1.8g-2.2g:5ml。
所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm,時間為10-20min,具體可為15min。
所述靜置的時間為3-5min,具體可為3min。
上述方法步驟2)中,所述加熱的時間為5-15min,具體可為10min。
所述冷卻的時間為3-5min,具體可為3min。
所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm,時間為5-10min,具體可為5min。
所述離心的條件為:4℃下4500-5500rpm離心5-10min,具體可為4℃下5000rpm離心5min。
上述方法步驟3)中,所述過濾采用0.45μm的尼龍濾膜。
所述Tris飽和酚的pH值為8.0。
所述上清液與Tris飽和酚的配比為3-4ml:2ml。
Tris飽和酚購自北京索萊寶科技公司。
所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm,時間為15-30min,具體可為20min。
所述離心的條件為:4℃下10000-13000rpm離心15-20min,具體可為4℃12000rpm離心20min。
上述方法步驟4)中,所述甲醇醋酸銨溶液的濃度為0.1M。
所述甲醇醋酸銨溶液的配制方法為:稱取0.7708g醋酸銨溶于80ml甲醇溶液中,并定容至100ml。
所述甲醇醋酸銨溶液與苯酚溶液的體積比為5-6:1。
上述方法步驟5)中,所述離心的條件為:4℃下13000-15000rpm離心15-20min,具體可為4℃15000rpm離心20min。
所述丙酮為預冷的丙酮。
所述清洗可進行多次,具體可為3次。
所述凍干的溫度為-80℃。
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