[發明專利]一種土壤蛋白質的提取方法

在審

• 申請號: 201710068838.8
• 申請日: 2017-02-08
• 公開（公告）號: CN106632582A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 李乃薈;吳鳳芝;陳宇飛;周新剛;劉守偉;潘凱
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K1/30
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,吳愛琴

技術領域

本發明涉及一種土壤蛋白質的提取方法。

背景技術

環境宏蛋白質組學是近年來興起的一種研究技術，該技術可以將土壤中復雜的微生物群體有效的進行綜合分析，以揭示土壤生態系統中的變化。

土壤環境中宏蛋白質組學的研究問題的關鍵在于，土壤蛋白質的提取和分析，其中蛋白質的提取是研究土壤環境的重點。土壤蛋白質的提取是土壤蛋白質組學研究的前提，然而由于土壤蛋白質提取方法的缺乏，當前土壤蛋白質組學的研究還不能有效的開展。因此，本發明針對土壤宏蛋白質提取方面的關鍵技術進行優化，以期本發明能在土壤宏蛋白質組學研究中做出一定貢獻。

發明內容

本發明的目的是提供一種有效的土壤蛋白質的提取方法。

本發明所提供的土壤蛋白質的提取方法，包括下述步驟：

1)向土壤樣品中加入土壤蛋白質提取緩沖液，震蕩，靜置；

2)置于沸水中加熱，于0℃冰水中冷卻，震蕩，離心；

3)將上清液過濾，向已過濾的上清液中加入Tris飽和酚，震蕩，離心，棄去上清液，收集下層苯酚溶液；

4)向下層苯酚溶液中加入甲醇醋酸銨溶液，-20℃放置6h-8h；

5)離心，將上清液移出，收集蛋白質沉淀，將蛋白質沉淀用丙酮清洗，凍干，得到蛋白質干粉。

上述方法步驟1)中，所述土壤蛋白質提取緩沖液為中性的蛋白質提取緩沖液，具體可為pH6.8的蛋白質提取緩沖液。

所述pH6.8的蛋白質提取緩沖液的配制方法為：稱取十二烷基硫酸鈉(SDS)1.25g，三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.2114g，NaCl 0.8766g，二硫蘇糖醇(DTT)0.386g，加入70ml雙蒸水溶解，使用濃鹽酸調節pH至pH 6.8，最后使用雙蒸水定容至100ml，即可。

所述土壤樣品與土壤蛋白質提取緩沖液的配比為1.8g-2.2g：5ml。

所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm，時間為10-20min，具體可為15min。

所述靜置的時間為3-5min，具體可為3min。

上述方法步驟2)中，所述加熱的時間為5-15min，具體可為10min。

所述冷卻的時間為3-5min，具體可為3min。

所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm，時間為5-10min，具體可為5min。

所述離心的條件為：4℃下4500-5500rpm離心5-10min，具體可為4℃下5000rpm離心5min。

上述方法步驟3)中，所述過濾采用0.45μm的尼龍濾膜。

所述Tris飽和酚的pH值為8.0。

所述上清液與Tris飽和酚的配比為3-4ml：2ml。

Tris飽和酚購自北京索萊寶科技公司。

所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm，時間為15-30min，具體可為20min。

所述離心的條件為：4℃下10000-13000rpm離心15-20min，具體可為4℃12000rpm離心20min。

上述方法步驟4)中，所述甲醇醋酸銨溶液的濃度為0.1M。

所述甲醇醋酸銨溶液的配制方法為：稱取0.7708g醋酸銨溶于80ml甲醇溶液中，并定容至100ml。

所述甲醇醋酸銨溶液與苯酚溶液的體積比為5-6：1。

上述方法步驟5)中，所述離心的條件為：4℃下13000-15000rpm離心15-20min，具體可為4℃15000rpm離心20min。

所述丙酮為預冷的丙酮。

所述清洗可進行多次，具體可為3次。

所述凍干的溫度為-80℃。