[發(fā)明專利]一種土壤蛋白質(zhì)的提取方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710068838.8
• 申請(qǐng)日: 2017-02-08
• 公開（公告）號(hào): CN106632582A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李乃薈;吳鳳芝;陳宇飛;周新剛;劉守偉;潘凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;C07K1/30
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,吳愛琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種土壤蛋白質(zhì)的提取方法。

背景技術(shù)

環(huán)境宏蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來興起的一種研究技術(shù)，該技術(shù)可以將土壤中復(fù)雜的微生物群體有效的進(jìn)行綜合分析，以揭示土壤生態(tài)系統(tǒng)中的變化。

土壤環(huán)境中宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究問題的關(guān)鍵在于，土壤蛋白質(zhì)的提取和分析，其中蛋白質(zhì)的提取是研究土壤環(huán)境的重點(diǎn)。土壤蛋白質(zhì)的提取是土壤蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提，然而由于土壤蛋白質(zhì)提取方法的缺乏，當(dāng)前土壤蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還不能有效的開展。因此，本發(fā)明針對(duì)土壤宏蛋白質(zhì)提取方面的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期本發(fā)明能在土壤宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究中做出一定貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種有效的土壤蛋白質(zhì)的提取方法。

本發(fā)明所提供的土壤蛋白質(zhì)的提取方法，包括下述步驟：

1)向土壤樣品中加入土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液，震蕩，靜置；

2)置于沸水中加熱，于0℃冰水中冷卻，震蕩，離心；

3)將上清液過濾，向已過濾的上清液中加入Tris飽和酚，震蕩，離心，棄去上清液，收集下層苯酚溶液；

4)向下層苯酚溶液中加入甲醇醋酸銨溶液，-20℃放置6h-8h；

5)離心，將上清液移出，收集蛋白質(zhì)沉淀，將蛋白質(zhì)沉淀用丙酮清洗，凍干，得到蛋白質(zhì)干粉。

上述方法步驟1)中，所述土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液為中性的蛋白質(zhì)提取緩沖液，具體可為pH6.8的蛋白質(zhì)提取緩沖液。

所述pH6.8的蛋白質(zhì)提取緩沖液的配制方法為：稱取十二烷基硫酸鈉(SDS)1.25g，三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.2114g，NaCl 0.8766g，二硫蘇糖醇(DTT)0.386g，加入70ml雙蒸水溶解，使用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH 6.8，最后使用雙蒸水定容至100ml，即可。

所述土壤樣品與土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液的配比為1.8g-2.2g：5ml。

所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm，時(shí)間為10-20min，具體可為15min。

所述靜置的時(shí)間為3-5min，具體可為3min。

上述方法步驟2)中，所述加熱的時(shí)間為5-15min，具體可為10min。

所述冷卻的時(shí)間為3-5min，具體可為3min。

所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm，時(shí)間為5-10min，具體可為5min。

所述離心的條件為：4℃下4500-5500rpm離心5-10min，具體可為4℃下5000rpm離心5min。

上述方法步驟3)中，所述過濾采用0.45μm的尼龍濾膜。

所述Tris飽和酚的pH值為8.0。

所述上清液與Tris飽和酚的配比為3-4ml：2ml。

Tris飽和酚購(gòu)自北京索萊寶科技公司。

所述震蕩的速度為3000rpm-3200rpm，時(shí)間為15-30min，具體可為20min。

所述離心的條件為：4℃下10000-13000rpm離心15-20min，具體可為4℃12000rpm離心20min。

上述方法步驟4)中，所述甲醇醋酸銨溶液的濃度為0.1M。

所述甲醇醋酸銨溶液的配制方法為：稱取0.7708g醋酸銨溶于80ml甲醇溶液中，并定容至100ml。

所述甲醇醋酸銨溶液與苯酚溶液的體積比為5-6：1。

上述方法步驟5)中，所述離心的條件為：4℃下13000-15000rpm離心15-20min，具體可為4℃15000rpm離心20min。

所述丙酮為預(yù)冷的丙酮。

所述清洗可進(jìn)行多次，具體可為3次。

所述凍干的溫度為-80℃。