[發(fā)明專利]耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710068441.9
• 申請日: 2017-02-08
• 公開（公告）號: CN106754373A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林海萍;趙樹民;虞方伯;郭愷;王勇軍;張心齊;張昕
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;A01N63/00;A01P21/00;C09K17/14;B09C1/10;C12R1/11;C09K101/00
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務(wù)所33233
• 代理人: 陳龍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于土壤治理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

治理土壤重金屬污染一直是國內(nèi)外面臨的巨大挑戰(zhàn)。植物修復(fù)因其低成本、無污染、不對土壤造成二次影響、操作簡單等特點在眾多的土壤重金屬修復(fù)技術(shù)中脫穎而出。然而用于植物修復(fù)的大部分超富集植物存在生物量小、生長緩慢、對重金屬具有選擇性等缺點限制了植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。

近年來，植物根際促生菌的深入研究為解決這一難題提供了新的思路。植物根際促生菌(PGPR)指生存于植物根際且有利于植物生長的微生物的總稱。其中有一類能夠產(chǎn)鐵載體(Siderophore)的根際細菌，產(chǎn)生的鐵載體既能給植物提供鐵營養(yǎng)，又能與其他重金屬結(jié)合，形成利于植物吸收的重金屬-鐵載體螯合物，增加植物對重金屬的富集和吸收，提高植物修復(fù)效率。產(chǎn)鐵載體細菌在植物修復(fù)中的作用主要體現(xiàn)為以下幾個方面：(1)為植物提供足量的鐵營養(yǎng)，緩解植物因缺鐵引起的各種癥狀；(2)影響土壤中重金屬生物有效性，分泌一些有機酸和鐵載體直接或間接地活化土壤中的重金屬，提高其生物可利用性；(3)產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如3-吲哚乙酸(IAA)、細胞分裂素和赤霉素等[6]，這些物質(zhì)在促進植物生長的同時也間接提高了其對重金屬的吸收；(4)協(xié)助植物獲得足量的營養(yǎng)元素，如氮、磷、鉀等，以保證植物在逆境條件下的最佳生長條件；(5)生防機制，通過搶占植物根系表面的有利生態(tài)位點與病原菌競爭營養(yǎng)(如鐵元素)；某些細菌還能通過產(chǎn)生抗生素的方式來抑制各種病原微生物的侵染。

中國專利文獻公開了一株新的巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用[申請?zhí)枺?01610081336.4]，保藏號：CCTCC NO：M2016033的巨大芽孢桿菌JD4(Bacillus megaterium JD4)，菌體生長快、酶系豐富，具有良好的產(chǎn)蛋白酶活力，其蛋白酶水解能力(Up)為83.60±4.84，遠遠高于已報道的同種菌株，能夠高效降解有機物，在生物有機肥、飼料添加劑、水質(zhì)改良劑領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

目前，已有相當(dāng)一部分具有促生效果的細菌從土壤中分離得到，并應(yīng)用于重金屬污染土壤的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)中。然而，在此過程中仍存在著兩個問題，一是大部分促生細菌并非從修復(fù)植物本身獲得，這可能造成菌株難以在植物體內(nèi)定殖，也有可能因引進外來微生物資源對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成影響。二是多數(shù)研究只是尋求功能單一的促生細菌，而對于促生功能全面、環(huán)境適應(yīng)能力強的土著促生細菌的報道相對較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法及應(yīng)用。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：一種耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法，其特征在于，取黑麥草植株，抖落黑麥草根系周圍的土壤后，剩下緊密附著在根系上的根際土壤，將根際土壤取下，加無菌水，震蕩后靜置，吸取上層土壤懸液，涂布于LB+2mg/L Cd²⁺的固體培養(yǎng)基平板上，恒溫倒置培養(yǎng)2-5d，挑取生長良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株。

在上述的耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法中，所述的根基土壤與無菌水的重量比為1:10，根基土壤加無菌水后，在150r/min振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基平板上，25-30℃倒置培養(yǎng)3-4d，挑取生長良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株，-80℃及以下溫度保存。

在上述的耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離方法中，所述的根基土壤與無菌水的重量比為1:10，根基土壤加無菌水后，在150r/min振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸液1mL，10倍系列稀釋，依次制備若干不同稀釋度的懸液，各取100μL涂布于LB+2mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)3d，挑取生長良好的單菌落劃線純化，得到耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株，-80℃及以下溫度保存。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對提高鎘脅迫下黑麥草種子發(fā)芽率的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對土壤溶磷的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株在土壤中產(chǎn)鐵載體的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對植物促生的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株在鎘污染土壤的修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對土壤中鎘的活化的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及按分離方法得到的菌株對土壤中銅的活化的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：