[發明專利]一種香菇申香15號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201710067947.8
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106755510A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 尚曉冬;張美彥;章爐軍;宋春艷;姜寧;于海龍;譚琦;李玉;周峰;董慧
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達,魏峯

1.一種香菇申香15號菌種的SSR標記指紋圖譜的鑒定方法，其具體步驟如下：

(1)菌絲培養：將香菇菌種轉接到裝有100ml馬鈴薯葡萄糖培養基PDB的三角瓶中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-5d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取：用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；

CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：

a將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，間或輕搖混勻；

b 12000rpm、4℃離心20min，取上清液；

c在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；

d在上述離心管中加入體積比為2∶1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

e在上述離心管中加入相對于步驟(4)中的上清液2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；

f將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

g加入預冷的95vol％乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

h加入100μL 1×TE沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；

i加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

j將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用；

(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；

PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反應條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環；72℃5min；

(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與2μL加樣緩沖液混勻，于95℃變性5min，結束后置于冰水混合物中冷卻3min，點樣3μL于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結果；

銀染的具體工藝為：電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分后，在銀染液中避光銀染8min，銀染后，用去離子水水洗5-8s，瀝干水分，放入顯影液中，至顯影后取出水洗后即可讀數；銀染液、顯影液均可用3-4次；

采用8對SSR引物對香菇菌株進行PCR擴增，通過對照50bp ladder DNA marker可確定各SSR引物擴增的等位片段的數量和相對分子量，找到帶型符合編號組合為：(0)(2)(3)(2+5)(3+4)(1+4)(1)(1)的菌種，即可確定該菌種為香菇申香15號菌種；

其中，8對SSR引物序列如下：

1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；

反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；

76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；

反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；

43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；

反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；

16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；

反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；

19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；

反向引物：TTGAAGCCTGACAGAGTG；

148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；

反向引物：TACCTCGTGCGGACTTTGAT；

002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；

反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；

192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；

反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC。