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[發(fā)明專利]一種香菇申香15號(hào)菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用在審

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201710067947.8 申請日: 2017-02-07
公開(公告)號(hào): CN106755510A 公開(公告)日: 2017-05-31
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 尚曉冬;張美彥;章爐軍;宋春艷;姜寧;于海龍;譚琦;李玉;周峰;董慧 申請(專利權(quán))人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
主分類號(hào): C12Q1/68 分類號(hào): C12Q1/68
代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所31233 代理人: 黃志達(dá),魏峯
地址: 201106 *** 國省代碼: 上海;31
權(quán)利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 一種 香菇 15 菌種 ssr 標(biāo)記 指紋 圖譜 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用
【權(quán)利要求書】:

1.一種香菇申香15號(hào)菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的鑒定方法,其具體步驟如下:

(1)菌絲培養(yǎng):將香菇菌種轉(zhuǎn)接到裝有100ml馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDB的三角瓶中,23-25℃下避光搖瓶培養(yǎng),3-5d后收集菌絲;

(2)基因組DNA的提取:用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA,紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度,調(diào)整樣品DNA的濃度一致;

CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括:

a將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末,加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液,于65℃保溫45-60min,間或輕搖混勻;

b 12000rpm、4℃離心20min,取上清液;

c在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液,輕輕混勻10min,12000rpm、4℃離心10min,取上清液移入離心管中;

d在上述離心管中加入體積比為2∶1的氯仿和異戊醇混合液,輕輕混勻10min,12000rpm、4℃離心10min,取上清液移入另一離心管中;

e在上述離心管中加入相對(duì)于步驟(4)中的上清液2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇,輕輕搖動(dòng)5min,8000rpm、4℃離心10min,去上清;

f將得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次,每次8000rpm,室溫離心5min;

g加入預(yù)冷的95vol%乙醇,輕輕上下顛倒,8000rpm室溫離心10min,棄乙醇,真空抽干或自然晾干;

h加入100μL 1×TE沖液,輕輕敲打使沉淀溶解;

i加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;

j將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用;

(3)SSR分子標(biāo)記的檢測:對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行基因SSR標(biāo)記的PCR擴(kuò)增;

PCR擴(kuò)增體系為:總體積20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl2 2μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR標(biāo)記正向引物和反向引物總體積各1.5μL,濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;

PCR反應(yīng)條件:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);72℃5min;

(4)電泳檢測:將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與2μL加樣緩沖液混勻,于95℃變性5min,結(jié)束后置于冰水混合物中冷卻3min,點(diǎn)樣3μL于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6%,電泳緩沖液為1×TBE,電壓1000v,電流200mA,功率200W,電泳45min,銀染,顯色,拍照,分析結(jié)果;

銀染的具體工藝為:電泳完成后卸下并拆開玻璃板,膠板卸下后,用去離子水水洗5-8s,瀝干水分后,在銀染液中避光銀染8min,銀染后,用去離子水水洗5-8s,瀝干水分,放入顯影液中,至顯影后取出水洗后即可讀數(shù);銀染液、顯影液均可用3-4次;

采用8對(duì)SSR引物對(duì)香菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過對(duì)照50bp ladder DNA marker可確定各SSR引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對(duì)分子量,找到帶型符合編號(hào)組合為:(0)(2)(3)(2+5)(3+4)(1+4)(1)(1)的菌種,即可確定該菌種為香菇申香15號(hào)菌種;

其中,8對(duì)SSR引物序列如下:

1140正向引物:CCCAAAAAGGATTTCAGCAA;

反向引物:AACCGGAGTGGTGTAAGTGC;

76正向引物:AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC;

反向引物:ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG;

43正向引物:CTCTTTGCACCCTCAACCTC;

反向引物:CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC;

16正向引物:ATAGGATGATTGAACGAGCAG;

反向引物:ACCGTAAGGTGGGAAGAAA;

19正向引物:ATGCCGTTCCAAAGATAC;

反向引物:TTGAAGCCTGACAGAGTG;

148-1正向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;

反向引物:TACCTCGTGCGGACTTTGAT;

002正向引物:GGGCGAAACAATTTCAGGTA;

反向引物:ATGCCATCGTAAGGAACTCG;

192-1正向引物:ACGCGTATCCTCCCCTAAGT;

反向引物:AAGCGATATGGATTTGACGC。

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