[發明專利]一種用于檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒

在審

• 申請號: 201710067501.5
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106872428A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 杜飛
• 申請（專利權）人: 遠見生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海恒慧知識產權代理事務所(特殊普通合伙)31317
• 代理人: 張寧展

技術領域

本發明涉及一種用于檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒，屬于檢驗技術領域。

背景技術

正常機體受到外界病原微生物等的刺激后，通過一系列固有免疫和適應性免疫反應抵抗感染、行使免疫防御功能。其中，固有免疫是機體先天獲得的第一道防線，出現早且反應迅速，在機體清除病原體的過程中發揮重要作用。中性粒細胞是固有免疫系統的重要組成部分。中性粒細胞在吞噬病原體過程中產生超氧陰離子和其他反應性氧復合物，即“呼吸爆發”，參與機體非特異性的抗感染過程。中性粒細胞呼吸爆發功能缺陷常見于臨床上的慢性肉芽腫患者，以及其他生理病理或藥物作用導致中性粒細胞功能缺陷的患者。慢性肉芽腫一種罕見的原發性免疫缺陷病，患者由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶復合物組分缺陷，不能產生活性氧中間體(reactive oxygen intermediates，ROI)，因此臨床表現反復細菌和真菌感染，嚴重者可危及生命。目前已發現慢性肉芽腫有2種不同的遺傳方式，即X染色體隱性遺傳(CYBB基因缺陷導致)和常染色體隱性遺傳(CYBA、NCF1、NCF2和NCF4基因缺陷導致)兩種方式。由于該病的臨床表現與其他免疫缺陷類疾病以及感染類疾病十分類似，因此僅通過臨床表現并不能將其與其他病種區分開來。因此，慢性肉芽腫病臨床上主要是基于體外檢測中性粒細胞刺激后消耗氧和產生氧代謝物是否缺陷來診斷的。然而目前，國內僅有北京和上海少數幾家兒童專科醫院能夠行中性粒細胞呼吸爆發功能檢測實驗，絕大多數醫院不具備檢測技術和條件。大部分疑似病例需要從外地趕至北京上海進行相關檢測，成本高且不易操作。另外，由于各家醫院檢測手段不完全相同，沒有統一的判斷標準。尤其針對常染色隱性遺傳的患者來說，由于其中性粒細胞呼吸爆發功能并非完全喪失，因此實驗偏差很容易影響到臨床醫師最后的診斷結果。另外，國內市場上僅有一家公司在售相關試劑盒，但未排除內源性過氧化氫酶對于實驗結果的影響，這將會導致實驗結果的不穩定性。因此，研發、制備穩定的中性粒細胞呼吸爆發功能檢測試劑盒將極大地促進慢性肉芽腫病的診斷，并可促進中性粒細胞呼吸爆發功能相關的臨床診斷和基礎研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種穩定的用于檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒。本發明的試劑盒用于檢測中性粒細胞產生活性氧的能力，尤其適用于臨床篩查慢性肉芽腫患者，亦可用于其他各種生理病理條件，以及藥物作用對于中性粒細胞呼吸爆發功能的影響。本試劑盒不僅限于人類樣本的檢測，還可用于其他物種，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、豬等。

為實現上述目的，本發明中，我們提供一種用于檢測中性粒細胞呼吸爆發功能試劑盒。該試劑盒主要基于二氫羅丹明123(Dihydrorhodamine 123,DHR123)流式細胞分析法，利用少量的周血全血即可完成檢測。其原理為：首先在測試樣本中加入過氧化氫酶以分解內源性的過氧化氫，消除樣本間差異，然后加入DHR123。DHR123是一種小分子化合物，可自由進入細胞。再加入佛波酯(Phorbol Myristate Acetate,PMA)溶液，中性粒細胞在PMA的刺激下可產生過氧化氫等活性氧。DHR123在過氧化氫和超氧陰離子等活性氧的作用下DHR123可生成羅丹明123(rhodamine123,R123)，產生綠色熒光。通過流式細胞術檢測綠色熒光的表達情況即可判斷中性粒細胞產生活性氧的能力。本發明的技術方案具體介紹如下。

一種用于檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒，該試劑盒包括如下組分：PMA溶液、DHR123溶液、過氧化氫酶溶液、平衡液、洗滌液、紅細胞裂解液和稀釋液。

本發明中，PMA溶液的濃度是20μg/ml；DHR123溶液的濃度是90μg/ml；過氧化氫酶溶液的濃度是20U/μl。

本發明中，平衡液為生理鹽水；洗滌液為PBS溶液；稀釋液為PBS溶液。

本發明中，試劑盒用于檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的方法如下：

第一步，取受試樣本，置于流式細胞管底部，檢測分別為靜息組、對照組和實驗組，每管50μl；如果受試樣本為血液樣本，則每管加入1ml 1x紅細胞裂解液，室溫避光孵育8～15分鐘；然后離心，去除上清，并用洗滌液清洗1-2次，每管加入50μl稀釋液；如果受試樣本為細胞樣本，則洗滌后直接加入50μl稀釋液；