[發明專利]CHO細胞高效表達TD?bFGF融合蛋白的構建方法和應用

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• 申請號: 201710067472.2
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106699900A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京佳華戴維生物技術有限公司;青島博隆實驗動物有限公司;唐山怡安生物工程有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;A61K8/64;A61K9/12;A61K8/04;A61Q19/00;A61P17/00
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1.一種融合蛋白TD-bFGF，其特征在于：所述融合蛋白TD-bFGF的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者與SEQ ID No.2所示序列具有至少75%的同一性。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于，所述同一性為至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。

3.根據權利要求1所述的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于，在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端連接上選自如下組的標簽：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc、MPG、VP22、TD34、TD、Tat48-60和/或Tat47-57。

4.與所述融合蛋白TD-bFGF相關的生物材料，為下述B1）-B5）中至少一種：

B1）編碼上述融合蛋白TD-bFGF的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表達盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重組載體、或含有B2）所述表達盒的重組載體；

B4）含有B1）所述核酸分子的重組微生物、含有B2）所述表達盒的重組微生物、或含有B3）所述重組載體的重組微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的重組細胞系、含有B2）所述表達盒的重組細胞系、或含有B3）所述重組載體的重組細胞系。

5.根據權利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子是DNA，例如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子或是RNA，例如mRNA或hnRNA。

6.根據權利要求4所述的生物材料，其特征在于，B1）所述核酸分子為如下1）-4）中任一所示的基因：

1）核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；

2）編碼序列是SEQ ID No.1第11-613位所示的DNA分子或cDNA分子；

3）與1）或2）限定的DNA分子具有75%以上同一性，且編碼所述融合蛋白TD-bFGF的DNA分子或cDNA分子；

4）在嚴格條件下與1）或2）或3）中任一所述限定的DNA分子雜交，且編碼所述融合蛋白TD-bFGF的DNA分子或cDNA分子。

7.權利要求1-4任意一項所述融合蛋白TD-bFGF的制備方法，包括：

(1) 將合成的透皮肽片段和bFGF的融合基因連接入真核質粒載體構建真核表達質粒；

(2) 用轉染的方法將真核表達質粒轉染至CHO細胞株中；

(3) 用含G418的選擇培養基篩選整合入融合基因的穩定轉染細胞株；

(4) 通過SDS-PAGE電泳篩選出能夠高效表達融合蛋白的陽性克隆株；

(5) 進行重復低密度鋪板克隆篩后獲得穩定且融合蛋白表達量最高的陽性CHO單克隆細胞株；

(6) 將篩選得到的穩定表達融合蛋白陽性克隆株進行懸浮馴化與發酵；用SDS-PAGE電泳方法檢測收集蛋白液中融合蛋白的表達量；

(7) 收集發酵液進行蛋白純化，先通過HIS親和柱純化融合蛋白并除去大部分的雜蛋白，上樣除去部分雜蛋白并將目的蛋白換液至PBS溶液中；再用緩沖液上離子柱純化液，獲得純的目的蛋白；

(8) 經膜包置換至PBS緩沖液中，通過創傷測定和安全試驗進行評價。

8.權利要求1-3任意一項所述融合蛋白TD-bFGF在制備皮膚涂抹或噴霧制劑中的應用。

9.權利要求1-3任意一項所述融合蛋白TD-bFGF在制備化妝品中的應用。

10.一種皮膚涂抹或噴霧制劑，其特征在于，含有權利要求1-3任意一項所述的融合蛋白TD-bFGF。

11.含有權利要求1-3任意一項所述的融合蛋白TD-bFGF與其他蛋白質融合方法。