[發明專利]一種牙髓干細胞分離培養方法

在審

• 申請號: 201710067285.4
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106801033A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 張鳳寧
• 申請（專利權）人: 貴州泛特爾細胞生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/0775
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙)11504
• 代理人: 宋林清

1.一種牙髓干細胞分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，分離干細胞，將牙齒用滅菌過的紗布包裹住，置于臺鉗中，擠碎牙齒露出牙髓組織，將牙髓組織用剪刀剪碎，收集到離心管中，加入完全培養液保濕，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓組織30min；

S2，制備單細胞懸液，加入5倍于Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶總體積的完全培養液來終止分解，采用1000rpm離心10min，去除上層清液，再用完全培養液將細胞重懸，使用70μm的濾網過濾獲得原代細胞懸液；

S3，細胞種瓶，原代細胞種植密度采1×10⁴cell/cm²，或者按照一顆牙齒種植一個T25培養瓶；

S4，形成克隆，2天后進行首次換液，后面完全培養液每3天換一次，培養9至19天，每個原代細胞形成數目100左右的克隆細胞，進行原代細胞收獲及傳代；

S5，細胞傳代，按1×4000cell/cm²種植傳代細胞，間隔3至4天換液，待細胞生長達到70％～90％的匯合度時，進行傳代細胞收獲并再次傳代。

2.如權利要求1所述的牙髓干細胞分離培養方法，其特征在于：在S1步驟中，牙齒采用新鮮牛奶或者無菌生理鹽水保存，或者添加S/P抗生素的PBS緩沖液，在1℃至5℃之間的溫度進行保存，保存時間不超過48h。

3.如權利要求1所述的牙髓干細胞分離培養方法，其特征在于：在S1步驟中，清潔牙齒時，需要將牙齒表面的牙齦和周圍的組織刮去，依次使用碘酒和70％酒精清潔牙齒表面，防止口腔細菌的污染，之后再用生理鹽水洗滌5次，去除碘酒和酒精。

4.如權利要求1所述的牙髓干細胞分離培養方法，其特征在于：在S4步驟中，首次換液時需移除沒有貼壁的細胞。

5.如權利要求1所述的牙髓干細胞分離培養方法，其特征在于：在S5步驟中，細胞的傳代收獲采用第二代至第四代傳代細胞。

6.如權利要求1所述的牙髓干細胞分離培養方法，其特征在于：在S1至S5步驟中，細胞的培養溫度為37℃，CO₂的體積百分比為5％。