[發明專利]快速檢測鴨瘟病毒LAMP試劑盒

在審

• 申請號: 201710065991.5
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN107034311A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 徐景峨;王婧;余波;史開志;楊莉;吳位珩
• 申請（專利權）人: 貴州省畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所52100
• 代理人: 李亮,程新敏

技術領域

本發明涉及家畜飼養及疾病防治領域，尤其是一種快速檢測鴨瘟病毒LAMP試劑盒。

背景技術

鴨瘟(Duck plague，DP)又稱鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis， DVE)，是由皰疹病毒科的鴨瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的鴨、鵝和天鵝等水禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，主要臨床特征為體溫升高、兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭、頸部腫大，故該病在我國有些地方俗稱“大頭瘟”。鴨瘟自1923年首次在荷蘭報道，之后在世界各地許多養鴨國家均報導有該病的發生和流行，我國于1957年在廣州首次發現該病。多年來鴨瘟以高達90％的死亡率引起社會廣泛關注，另外該病傳播速度很快，加上集約化養鴨業鴨群密度高、流動頻繁、極易引起流行，而且該病在一個大流行期后常呈地方性流行，長期危害養鴨業，造成巨大的經濟損失。

目前對鴨瘟病毒的檢測方法主要有病毒分離鑒定、ELISA法、血清中和試驗及PCR技術等。但病毒分離鑒定方法在低毒力或非致病性毒株情況下可能不引起臨床癥狀；血清學中和試驗雖然結果準確，但程序復雜，耗時費力，不能用于快速診斷及大批量樣品的檢測；ELISA是目前使用最為廣發的一種方法，具有經濟、簡便、快速的特點，但靈敏度較PCR技術而言稍有差距；傳統PCR技術具有靈敏度高、特異性強等特點，但該檢測方法成本高，對操作者技術及反應儀器要求較高，擴增反應時間較長，不利于快速檢測及在基層實驗室的推廣應用。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本學者Notomi等建立的一種新的核酸擴增方法，原理是利用4條特殊設計的引物及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA，在1h內能達到 109靶序列拷貝。

發明內容

本發明的目的是：提供一種快速檢測鴨瘟病毒LAMP試劑盒，它能快速、準確的對鴨瘟病毒進行檢測，并且成本低廉，使用方便，以克服現有技術的不足。

本發明是這樣實現的：快速檢測鴨瘟病毒LAMP試劑盒，在 25μL體系DPV-TK LAMP擴增體系中包括，濃度為5mol/L的甜菜堿5μL，濃度為8000U/mL Bst DNA的聚合酶0.8μL，濃度為0.1mol/L 的硫酸鎂1.0μL，濃度為0.25mol/L的dNTPs 1.4μL，濃度為 10pmol/μL的外引物F3/B3各0.5μL，濃度為10pmol/μL的內引物 FIP/BIP各4.0μL，DNA模板1μL，1μL BYBR GreenI，其余由無核酸酶ddH₂O補足至25μL，其中，外引物F3的序列為 5’-TGCGAACGCTTAATCCGG-3’，外引物B3的序列為5’- TGCTATGTCACCTCGAGCT-3’；內引物FIP的序列為5’- GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’，內引物BIP的序列為5’-GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’；該體系在62℃擴增60min。

為了驗證本發明的技術效果，進行了以下試驗：

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株 本試驗的DPV活疫苗(雞胚化弱毒株)購自南京天邦生物技術有限公司，鴨疫里默氏桿菌標準菌株購自中國獸醫微生物保藏管理中心(CVCC)；DPV Gz株由貴州大學動物科技學院惠贈；DPV CHv強毒株、大腸桿菌、鴨疫里默氏巴氏桿菌、鴨沙門氏菌由本實驗室分離鑒定后保存。

1.1.2試劑和儀器 Bst 2.0DNA聚合酶購自New England Biolabs公司；Betaine(甜菜堿)、MgSO₄購自Sigma公司；dNTPs、無核酸酶ddH₂O、DL500DNA Maker、基因組DNA提取試劑DNAiso Reagant、購自寶生物(大連)工程有限公司；Gold view核酸染料、 50×TAE Buffer購自生工生物工程(上海)股份有限公司；梯度PCR儀 (Veriti)，Applied Biosystems公司；凝膠成像儀(Alpha Imager HP)，美國Alpha Innotech公司。