[發明專利]一種經濟實用型骨組織蛋白提取與分離方法

在審

• 申請號: 201710065717.8
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106749604A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 閔文;黃桂成;方彭華;袁翰;黃正泉;朱燕;韓龍;王磊;周龍云
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/14
• 代理公司: 北京市領專知識產權代理有限公司11590
• 代理人: 林輝輪

1.一種經濟實用型骨組織蛋白提取與分離方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)準備離心管并稱重、記錄其質量，將稱重后的離心管放置于冰上預冷，備用；

(2)量取磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑及苯甲基磺酰氟加入冷裂解緩沖液后，置于冰上并攪拌均勻，即得裂解液，其中，每1ml冷裂解緩沖液中加入5μl磷酸酶抑制劑、1μl蛋白酶抑制劑及5μl苯甲基磺酰氟；

(3)用注射針吸取生理鹽水將股骨上的骨髓沖洗掉，并稱取沖洗后的股骨干0.3～0.5g，備用；

(4)將步驟(3)中備用的股骨干放置于研缽內，并向研缽中加入液氮預冷研缽和股骨干，將預冷后的股骨干進行研磨5～10min直至股骨干成粉末狀，并在研磨期間向研缽內不斷加入液氮，即得粉末狀股骨干，備用；

(5)將步驟(4)中備用的粉末狀股骨干轉移至步驟(1)中備用的離心管中，再次稱重離心管，計算得出粉末狀股骨干的質量，將該質量乘以1/3后，按照0.2～0.4g/mL向離心管中添加步驟(2)中備用的裂解液，即得混合液，備用；

(6)將步驟(5)中備用的混合液在3～6℃的條件下震蕩15～20min，并將震蕩后的混合液靜置5～10min，即得懸濁液，備用；

(7)將步驟(6)中備用的懸濁液置于4℃、3000～5000rpm的條件下離心5～10min，即得上清液和沉淀，將上清液吸至新的離心管中并分裝保存在-80℃的條件下，即得骨組織蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種經濟實用型骨組織蛋白提取與分離方法，其特征在于：所述步驟(2)中裂解緩沖液為將10mL的1mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、200μL的0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和10mL的10％的十二烷基硫酸鈉溶液充分混合均勻后并用無菌水定容至100mL制得。

3.根據權利要求1所述的一種經濟實用型骨組織蛋白提取與分離方法，其特征在于：所述步驟(5)中按照0.2g/mL向離心管中添加裂解液。

4.根據權利要求1所述的一種經濟實用型骨組織蛋白提取與分離方法，其特征在于：所述步驟(6)中將混合液在4℃的條件下震蕩20min。

5.根據權利要求1所述的一種經濟實用型骨組織蛋白提取與分離方法，其特征在于：所述步驟(7)中將懸濁液置于4℃、3000rpm的條件下離心5min。