[發(fā)明專利]一種離心式固相酶切柱及其制備方法和用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710065609.0
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN107058093A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張彥明
• 申請（專利權(quán)）人: 北京美正生物科技有限公司
• 主分類號: C12M1/40
• 分類號: C12M1/40;C12P21/06
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種離心式的固相酶切柱的制備方法和用途。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉蛋白質(zhì)分子的酶解和分析。

背景技術(shù)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起，蛋白質(zhì)的精細(xì)分析越來越引起研究者的興趣。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是從整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成、活動規(guī)律及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用, 是功能基因組學(xué)時(shí)代一門新的學(xué)科。目前蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要有兩條路線:一是基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué);二是基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué), 其中基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)研究路線最終也離不開質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用。

質(zhì)譜分析包括質(zhì)譜檢測、軟件程序分析及數(shù)據(jù)庫檢索. 質(zhì)譜分析可以對蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行準(zhǔn)確測定. 通過數(shù)據(jù)庫檢索,質(zhì)譜分析可以比較被檢蛋白的多肽質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中蛋白的多肽質(zhì)譜,并以此為根據(jù)對被檢蛋白進(jìn)行鑒定. 而且,質(zhì)譜分析還可檢測到蛋白消化后形成的多肽的氨基酸序列,再通過數(shù)據(jù)庫檢索對蛋白進(jìn)行鑒定. 質(zhì)譜分析所獲得的蛋白氨基酸序列是對蛋白進(jìn)行鑒定的最準(zhǔn)確而有效的手段。

而對于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析來說，蛋白的基團(tuán)越大,質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率越低. 因此,在質(zhì)譜檢測之前,須將蛋白消化成小分子的多肽,以提高質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率. 一般而言,6-20個(gè)氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測. 現(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶( t rypsin) , 它于蛋白的賴氨酸( lysine) 和精氨酸( arginine) 處將其切斷. 因此,同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后,會產(chǎn)生相同的多肽.利于分析和比較。除了胰蛋白以外，胃蛋白酶、堿性蛋白酶等在蛋白質(zhì)分析中也有所應(yīng)用。

目前對于蛋白質(zhì)在質(zhì)譜前的酶切處理，常用的方法是在蛋白質(zhì)溶液中加入蛋白酶溶液，在適當(dāng)?shù)臏囟冗M(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解反應(yīng)完全以后加熱滅活蛋白酶。然后目的蛋白的酶解產(chǎn)物和滅活的蛋白酶同時(shí)進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

目前方法的缺點(diǎn)在于

1.目前蛋白酶酶解方法用時(shí)太長，通常的酶解時(shí)間都要在20小時(shí)左右，才能夠保證目的蛋白的充分酶解

2.目前方法的蛋白酶用量較大，因?yàn)闊o法將蛋白酶與酶切產(chǎn)物分離，蛋白酶是一次性使用。因此帶來的酶的成本很高

3.滅活的酶與目的蛋白酶解后的肽段同時(shí)進(jìn)入質(zhì)譜中，蛋白酶分子會對目的蛋白的分析造成一定的影響。

相對于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于

1.本發(fā)明采用了高酶活的蛋白酶固定于固相載體上，有效的提高了酶切效率。整個(gè)酶切反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成

2.裝填在離心柱中的固定化蛋白酶可以方便的與酶切產(chǎn)物分離。使蛋白酶可以重復(fù)利用，大幅度降低了酶切的成本

3.裝填在離心柱中的固定化蛋白酶可以方便的與酶切產(chǎn)物分離。使酶切產(chǎn)物中不帶有蛋白酶的組分。不會對目的蛋白的分析造成影響。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種離心式的固相酶切柱及其制備方法和用途

1.一種離心式的固相酶切柱，其特征在于該固相酶切柱包括一個(gè)離心柱組件及裝填在其中的固定有蛋白酶的填料

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所描述的離心柱組件，其特征在于包含一個(gè)離心柱以及一個(gè)離心柱套管

3.根據(jù)權(quán)利要求2描述的離心柱，其特征在于離心柱柱管包括柱體、上蓋、篩板、密封圈和下堵頭

4.根據(jù)權(quán)利要求3描述的離心柱柱管，其特征在于，柱管材料包括但不限于聚丙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯等。其中優(yōu)選聚丙烯材料

5.根據(jù)權(quán)利要求3所描述的離心柱篩板，其特征在于，篩板材料包括但不限于聚丙烯，混合纖維或者超高分子量聚乙烯。其中優(yōu)選超高分子量聚乙烯

6.根據(jù)權(quán)利要求3所描述的離心柱篩板，其特征在于篩板孔徑在1-200μm之間，其中優(yōu)選5-100μm

7.根據(jù)權(quán)利要求3所描述的密封圈，其特征在于密封圈外徑與離心柱柱體內(nèi)徑一致，或稍大于柱體內(nèi)徑，以保證密封效果

8. 根據(jù)權(quán)利要求3所描述的下堵頭，其特征在于下堵頭為一個(gè)帽型設(shè)計(jì)，下堵頭的內(nèi)徑與柱體出口的外徑一致以保證密封效果

9.根據(jù)權(quán)利要求3所描述的離心柱上蓋，其特征在于上蓋與柱體連為一體，且上蓋規(guī)格與柱體進(jìn)液口相匹配。蓋上上蓋后不會有液體漏出

10.根據(jù)權(quán)利要求2所描述的離心柱套管，其特征在于，離心柱套管的材質(zhì)包括但不限于聚丙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯等，其中優(yōu)選聚丙烯

11.根據(jù)權(quán)利要求2所描述的離心柱組件，離心柱套管的內(nèi)徑小于柱體最粗處的外徑，以保證離心時(shí)，離心柱不會陷入離心柱套管內(nèi)