[發明專利]一種單細胞分選用標簽珠的制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710064169.7
• 申請日: 2017-02-04
• 公開（公告）號: CN108396056A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 季劼;孫倍成
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G01N15/14
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 楊文晰;孫忠浩

本發明涉及一種單細胞分選用標簽珠的制備方法與應用，即通過特制帶有熒光和特殊堿基序列的標簽珠，通過流式細胞分選儀，實現將裂解出的單細胞內的mRNA進行標簽標記的功能，從而使得單細胞測序所需的分選工作變得更加簡潔高效，有效的解決了目前單細胞測序中分選困難標簽困難的技術難題，同時適合進行大規模的單細胞測序實驗。

技術領域

本發明涉及材料科學和生物化學領域，特別是一種單細胞分選用標簽珠的制備方法與應用。

背景技術

基因測序技術是一種對生物體內基因的排列序列進行檢測的技術。自從上世紀90年代初，人類便開始涉足“人類基因組計劃”，通過對人體內基因不同的堿基排序進行檢測得到一長串序列，再通過生物信息學技術對排序進行分析，得到有意義的信息，最終幫助人們進行診斷、科研、疾病預測等多種重要功能。

基因測序技術也如同其他技術一樣在日新月異的向著更快、更廉價、更精確的方向發展。隨著測序技術的發展及測序成本的大幅度下降，破譯來自單細胞的30億堿基的基因組并逐個細胞比較序列正在變為現實，即是將生物實驗的精確尺度推向單細胞級別，而非傳統的用含有上百萬細胞的組織進行實驗。

目前，單細胞的研究已經在蛋白質組學、顯微影像學等領域取得了初步的成果，研究發現單細胞的反應模式并非傳統通過大塊組織研究得到的“線性結果”，而是非0即1的數字化的結果。特別是在腫瘤研究領域，單細胞研究已逐漸發展為研究的重點領域。

雖然測序儀器的技術進步使得單細胞測序變為可能，但是單細胞研究仍舊面臨著非常大的困難。即是如何標記單個細胞以及單個細胞中的各條mRNA序列。目前通用的方法是將單個細胞通過流式細胞儀分選到96孔板的單個孔中，再通過聚合酶鏈反應技術將特異序列的引物加在基因序列上，通過橫豎排的多種序列來進行單細胞的定位，再進行測序。但是通過橫豎排不同的序列來定位細胞的技術在加樣過程中容易交叉污染導致可靠性不足，同時每次加樣過程中都需要對橫豎排分別加樣導致耗時巨大效率低下，并且每橫排和每豎排都需要使用特制的引物，極大的限制了大規模分選的使用。

發明內容

針對上述問題，本發明提供一種攜帶有特定熒光序列和堿基序列的標簽珠，該標簽珠可以通過流式細胞分選儀對特定單細胞內mRNA進行標簽標記，從而簡化單細胞分選工作，本發明是這樣實現的：

1、一種單細胞分選用標簽珠的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）在珠子表面上合成熒光基團6-FAM；

2）將珠子等分成四份，分別在珠子表面合成單個的脫氧鳥苷酸、脫氧腺苷酸、脫氧胸苷酸和脫氧胞苷酸；合成完畢后，將四份珠子混合后再隨機等分成四份，再次分別合成上述四種脫氧核苷酸，如此重復合成步驟，共合成12次，最終合成一段長12個脫氧核苷酸的各個珠子不相同的序列，即為A序列；

3）將四份珠子全部混合后加入含有脫氧鳥苷酸、脫氧腺苷酸、脫氧胸苷酸和脫氧胞苷酸的混合溶液中再次合成反應8次，最終合成一段長8個脫氧核苷酸的隨機序列，即為B序列；

4）將珠子加入脫氧胸苷酸溶液中再次合成反應30次，形成C序列，即獲得依次連接熒光基團6-FAM以及序列ABC的單細胞分選用標簽珠。

優選的，本發明所述單細胞分選用標簽珠的制備方法步驟1）中，所述珠子直徑為10-50um。

如本發明制備的單細胞分選用標簽珠在單細胞測序樣本制備過程中的應用。

如本發明所述單細胞分選用標簽珠在分選癌癥組織與免疫細胞的單細胞中的應用。