[發明專利]一種基于核糖體結合位點改造的啟動子優化方法

有效

• 申請號: 201710062695.X
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106939310B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 陳守文;彭炳;何鵬輝;蔡冬波;陳耀中;王勤;魏雪團
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

一種基于核糖體結合位點改造的啟動子優化方法，S1、具體為將枯草芽胞桿菌中P43啟動子的轉錄起始位點后的核糖體結合位點的序列擴增；S2、再通過引物設計，擴增出帶核糖體結合位點序列的P43啟動子，以獲得具有至少一種結構功能的序列。其優點是：將P43啟動子中核糖體結合位點進行本發明的優化方法，使得優化后的啟動子與mRNA的結合水平提高，繼而提高了目的基因的表達水平。

技術領域

本發明涉及基因工程和微生物工程技術領域，具體地說是一種基于核糖體結合位點改造的啟動子優化方法。

背景技術

啟動子是一段位于結構基因5’端上游區的DNA序列，是DNA分子上被RNA聚合酶和轉錄調節因子等識別并結合形成轉錄起始復合物的區域。啟動子的保守結構特征有：-10區、-35區、兩個區之間的間隔距離和轉錄起始位點TSS。兩個識別區之間的序列雖然并不保守，但是其間隔距離的保守性對于RNA聚合酶結合時的空間幾何構象十分重要。之前研究結果表明，啟動子-10位的TATA區和-35位的TTGACA區是RNA聚合酶與啟動子的結合位點，能與σ因子相互識別而具有很高的親和力。原核生物中-10區同-35區之間核苷酸數目的變動會影響基因轉錄活性的高低，強啟動子一般為17±1bp，當間距小于15bp或大于20bp時都會降低啟動子的活性。同時，-35區共有序列5’-TTGACA-3’跟-10區共有序列5’-TATAAT-3’高度保守，對于大多數啟動子來說，-10區與-35區的序列與共有序列的相似程度越高，其啟動子的轉錄強度越高。啟動子上與RNA聚合酶核心酶和σ因子互作的功能區域包括-35區、-10區、擴展的-10區(extended-10)、上游增強元件(UP element)和+1區的轉錄起始位點，一些啟動子還存在著與激活蛋白與阻遏蛋白結合的位點。不同啟動子表現出的轉錄效率高低，歸根結底在于功能結構序列的不同，如何通過對上述結構的缺失、添加和突變，以得到適用于生產應用和理論研究的理想啟動子，使目前亟待解決的問題。

mRNA是生物信息傳遞鏈中的重要一環，與蛋白質翻譯密切相關，有效的翻譯起始決定蛋白質能否順利進行翻譯(Gold 1988)。mRNA的5’端非編碼區存在著一個重要的功能元件：核糖體結合位點RBS，也即原核生物中的SD序列。原核生物翻譯需要核糖體與核糖體結合位點和起始密碼子同時結合，核糖體的16S序列與RBS互補配對，起始轉運RNA(tRNA)與起始密碼子結合，從而開始翻譯蛋白。研究表明mRNA的5’端形成的二級結構對于翻譯起始會產生重要影響，如果SD序列和起始密碼子位于較穩定的發夾結構中，那么核糖體識別難度會大幅增加，導致翻譯起始效率降低，蛋白表達水平下降。

發明內容

為了解決上述技術缺陷，本發明提供一種用于提高產量的啟動子及其制備方法，以增強核糖體識別能力，提高翻譯起始效率和外源蛋白表達水平。

本發明一方面，提供一種基于核糖體結合位點改造的啟動子優化方法，S1、具體為將枯草芽胞桿菌中P43啟動子的轉錄起始位點后的核糖體結合位點的序列擴增；S2、再通過引物設計，擴增出帶核糖體結合位點序列的P43啟動子，以獲得具有至少一種結構功能的序列。

本發明第二方面，保護一種通過上述方法獲得的啟動子。

本發明第三方木，保護一種含第二方面所述啟動子的載體。

一種基于核糖體結合位點改造的啟動子優化方法，其優點是：將P43啟動子中核糖體結合位點進行本發明的優化方法，使得優化后的啟動子與mRNA的結合水平提高，繼而提高了目的基因的表達水平。

附圖說明

圖1A、1B為啟動子P43轉錄產物5’端非翻譯區二級結構圖示

其中圖1A是根據文獻報導，啟動子P43轉錄出的序列推測在5’端會形成的一個發夾結構(Wang et al 1984)；

圖1B為Mfold軟件推定的結構；