[發明專利]一種流感病毒四價亞單位疫苗及其應用

在審

• 申請號: 201710061575.8
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN106822887A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 嚴景華;高福;馬素芳;毛子安;毛卓玥
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所;浙江普康生物技術股份有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種流感病毒四價亞單位疫苗及其應用，屬于醫藥技術領域。

背景技術

流行性感冒病毒(influenzavirus)，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，流感病毒屬于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)。流感病毒會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或小孩及一些免疫失調的病人會引起較嚴重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等。

流感病毒主要由囊膜和核衣殼構成，囊膜由纖突、雙層類脂膜和基質蛋白(M)構成。纖突分為兩類：一類呈棒狀，由血凝素(HA)分子的三聚體構成；另一類呈蘑菇狀，由神經氨酸酶(NA)分子的四聚體構成。雙層類脂膜為病毒粒子出芽時從宿主細胞膜獲得的。基質蛋白緊密排列在囊膜內側，是維持病毒形態的結構蛋白。基質蛋白內部包圍著核衣殼，核衣殼由8個呈螺旋形排列的RNA-核蛋白復合物(RNP)構成，每個RNP由一個單股負鏈RNA外面包被著核蛋白(NP)形成，流感病毒基因組的8個負鏈RNA就形成了8個RNP。按照核蛋白NP和基質蛋白M抗原性的不同，流感病毒被分為A、B、C三型，也有學者稱為甲、乙、丙三型。它們沒有共同的抗原，但都能感染人，其中以A型流感病毒的流行規模最大。各型流感病毒又根據其病毒粒子表面的血凝素(HA，簡寫為H)和神經氨酸酶(NA，簡寫為N)抗原性的不同而被分為多種亞型，其中A型流感病毒中已經發現的H亞型有18種，N亞型有11種，H和N亞型可以形成不同的組合，如H1N1、H5N1、H3N2、H9N2亞型等。

四次大流感的暴發和每年季節性流感的傳播嚴重威脅著人類健康并造成重大經濟損失，不時突現的高致病性禽流感時刻警示人類新一輪大流感暴發的潛在可能。流感病毒的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)是病毒囊膜表面一個主要的抗原蛋白。HA蛋白最基本的功能是識別受體和膜融合，在病毒粒子包裝和出芽過程中也起到一定的作用。HA分子與流感病毒的宿主范圍、毒力、傳播能力，以及人類新流行毒株或大流行毒株的出現有密切的關系，也是藥物和疫苗設計主要的靶分子。

流感病毒疫苗接種是當前人類預防流感的首選措施。然而，由于流感病毒血清型眾多，一旦流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，就會導致疫苗失效，無法提供相應的保護，無法對所有類型的流感病毒提供交叉保護。目前已經批準上市的疫苗都是病毒裂解疫苗，即滅活疫苗，如GSK公司生產的Quadrivalent和賽諾非巴斯德公司生產的都是多價的流感病毒裂解疫苗。該類疫苗需要先制備流感病毒活病毒，因此生產過程存在安全風險，而且生產成本也大大增加。目前尚無批準上市的流感病毒亞單位疫苗。

發明內容

本發明針對季節性流感病毒H3N2、2009年大流感的H1N1病毒和B型流感病毒B35和B51，我們設計了四價流感病毒亞單位疫苗，分別選取流感病毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/HongKong/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B35)和B/Massachusetts/2/2012(B51)，分別構建其HA胞外區的桿狀病毒表達質粒，通過昆蟲細胞表達系統分別獲得了可溶性的蛋白H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，并利用分子篩和離子柱純化獲得了高純度的三聚體目的蛋白，通過免疫小鼠實驗和細胞中和實驗，驗證了該四價疫苗的有效性。

本發明的第一個目的是提供一種四價蛋白質疫苗，包括四種蛋白，所述蛋白質分別命名為H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，其氨基酸序列份為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；這四個蛋白分別是在H1N1亞型流感病毒株血凝素、H3N2亞型流感病毒株血凝素、B型流感病毒株B35亞型血凝素、B型流感病毒株B51亞型血凝素的胞外區的前面加上了GP67信號肽序列，后面加上凝血酶酶切位點、fibritin的三聚體標簽和6×His標簽。

所述蛋白質疫苗還包括佐劑，包括鋁佐劑、MF59佐劑。

所述蛋白質疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)構建重組質粒