[發(fā)明專利]棉花轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710061030.7
• 申請(qǐng)日: 2017-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106868038B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周瑞陽(yáng);劉冬梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H1/02;A01H5/00;A01H6/60
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.棉花轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建

將從紅麻中克隆獲得的Hcpdil5-2a基因非全長(zhǎng)CDS序列插入到PBI121-GFP載體的XbaI和Kpn I酶切位點(diǎn)之間，即構(gòu)建得到重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；

S2、轉(zhuǎn)基因棉花植株的構(gòu)建

采用花粉管通道法將重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP導(dǎo)入棉花植株中，收獲轉(zhuǎn)基因棉花植株的T₀代種子；

S3、轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源的獲得

播種上述T₀代種子獲得T₁代植株，于開(kāi)花期調(diào)查T₁代植株育性，選擇雄性不育株；

對(duì)于沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雄性不育株的群體，采用“一粒傳”混合選擇法于每株收獲1～2個(gè)自交果實(shí)即為T₁代種子；播種T₁代單株種子獲得T₂代株系，選擇雄性不育株；

將上述選出的雄性不育株作為棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源；

S4、棉花轉(zhuǎn)基因細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育

(1)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之一：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)資源為母本，以其野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系回交，成熟期收獲T₁代種子，然后播種，觀察T₂代植株育性，如果仍表現(xiàn)為雄性不育，表明其為細(xì)胞質(zhì)遺傳的雄性不育，繼續(xù)與原回交親本進(jìn)行核置換飽和回交所得的雄性不育系，即為質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系即為該不育系的保持系；

(2)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之二：以轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育過(guò)程中任一世代的雄性不育株為母本，與不育株原始來(lái)源相同的野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系雜交，并與該親本進(jìn)行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，也屬于質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系；

(3)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)或轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育過(guò)程中任一世代的雄性不育株為母本，與其異源保持系或常規(guī)品種或品系雜交，并與回交親本進(jìn)行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，即為質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系；

其中，所述異源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料沒(méi)有親緣關(guān)系的雄性不育保持系或常規(guī)品種或品系；

Hcpdil5-2a基因非全長(zhǎng)CDS序列如SEQ ID NO:1所示；

步驟S2具體如下：

S21、選株：選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的栽培品種棉花植株，將次日要開(kāi)放的花蕾，用夾子將花蕾頂部夾住或使用線繩將花蕾頂部扎緊使其不能正常開(kāi)放，以防外來(lái)花粉污染；

S22、微量注射重組表達(dá)載體：開(kāi)花次日早上5-6點(diǎn)，花粉管通道已經(jīng)形成，去掉夾子或線繩，使花瓣張開(kāi)，拔掉柱頭，同時(shí)用消毒的微量進(jìn)樣器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒溶液，注入子房中；

S23、收獲：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒的棉花植株果實(shí)成熟后，收集的種子即為T₀代種子；

S21中所述栽培品種為海島棉D(zhuǎn)P353；

步驟S4中所述異源保持系選自以下棉花品種：吉扎75、吉扎77、巴2365、魯什涅、海新86225、DP744、海輻6號(hào)、陸地棉品種或品系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S4在回交過(guò)程中，于每個(gè)世代選擇性狀與父本相似，且花藥不開(kāi)裂的雄性不育株繼續(xù)回交，同時(shí)父本套袋自交。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核置換回交或核置換飽和回交的回交世代數(shù)不低于6代。