[發明專利]一種添加乙二醇促進亞麻刺盤孢霉高效轉化DHEA的方法

在審

• 申請號: 201710060671.0
• 申請日: 2017-01-25
• 公開（公告）號: CN106591411A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 李會;許正宏;史勁松;李聰;倪瑜;張曉梅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P33/06
• 分類號: C12P33/06;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種添加乙二醇的方法提高亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST-1羥化去氫表雄酮(DHEA)為7α-羥基-去氫表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羥基-去氫表雄酮(7,15α-diOH-DHEA)的方法。

背景技術

去氫表雄酮(DHEA)、膽固醇、孕甾烯醇酮等一些主要的3-羥基甾體，在自然界生物體內，會轉化成為相應的7α-羥基甾體衍生物。近幾年來，去氫表雄酮，7α-羥基-去氫表雄酮及7,15α-羥基-去氫表雄酮的重要生物學活性，更加受到人們的重視。目前，有研究發現7α-OH-DHEA可以阻止體外神經元的缺氧細胞死亡，而且具有明顯的抗氧化作用和抗腫瘤作用，可以將其作為一種具有重要藥理作用和藥用價值的羥基甾體化合物；而雙羥化產物7,15α-羥基-去氫表雄酮(7,15α-diOH-DHEA)，作為一種重要的甾體藥物中間體，可用于合成多種甾體激素類藥物，如合成“第四代”口服避孕藥的主要成分屈螺酮。由于上述兩種去氫表雄酮的羥化產物都具有重要藥理作用和藥用價值，應用前景十分看好，成為當前藥物研究領域中的熱點之一。

但是，去氫表雄酮及其羥基化衍生物為內源性物質，生物體內貯存量極低，來源受限，導致其研究工作受到了一定的限制。且其結構復雜，羥基的空間立體選擇性要求高，故采用傳統的全化學合成比較困難，成本高、得率低而且重污染。隨著生物轉化技術的興起，利用微生物轉化技術對甾體進行選擇性修飾引起了人們的高度重視，該反應具有條件溫和，安全低耗、易操作、轉化率高且環境友好等特點。據相關文獻報道，目前已有總狀毛霉(Mucor racemosus)等菌株具備轉化DHEA為7α-羥化報道，但對7,15α-OH-DHEA的研究極少。在利用微生物對甾體化合物進行轉化的過程中，由于甾體是是脂溶性化合物，在水相中溶解度極低，從而極大限制其轉化效率。針對這一問題，研究人員嘗試將多種有機溶劑引入甾體生物轉化過程，發現部分有機溶劑除了具有“助溶劑”效果之外，還可以被細胞體內生物酶代謝，生成輔酶NADH和NADPH，實現還原性輔酶的再生循環，常見的如使用甘油、異丙醇等化合物，但對甾體轉化率的提高幅度不大。因此，在亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)ST-1羥化DHEA過程中，選用16種常見的有機溶劑進行分析，發現添加乙二醇能夠顯著提高DHEA的轉化率和產物的總得率，而目前關于添加乙二醇用于亞麻刺盤孢羥化DHEA的方法未見報道，其顯著提高底物的水溶性、轉化率，降低生產成本更是工業生產的一大優勢。

發明內容

本發明的目的在于提供一種添加乙二醇來提高亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)ST-1羥化去氫表雄酮的方法，通過添加適量的乙二醇，顯著提高底物投料濃度，達到高轉化率和高產物得率的要求。該菌于2012年4月24日保藏在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6051，分類命名為亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)。

應用上述微生物轉化DHEA生產7α-OH-DHEA和7,15α-diOH-DHEA的方法，其步驟如下：

(1)采用保藏號為CGMCC No.6051的亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)ST-1為生產菌種，25-40℃，150-220r/min條件下活化培養得到種子液，然后將種子液涂布到PDA培養基上；

(2)制備亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)ST-1菌株的細胞液體培養物：挑取步驟(1)的PDA固體培養基上的亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)ST-1菌株一環，接種于已滅菌的裝有20-60mL種子培養基的250mL錐形瓶中，培養溫度為25-40℃，置搖床上以150-220r/min的轉速培養12-16h至對數生長中期，即得到亞麻刺盤孢霉(Collectotrichum lini)ST-1菌株的細胞液體培養物；

(3)發酵培養：將步驟(2)中制備好的細胞液體培養物以8-10％(v/v)的接種量接入發酵培養基，裝液量為250mL錐形瓶中裝20-60mL發酵培養基，培養溫度為25-40℃，在150-220r/min的轉速下培養20-24h，得發酵液。