[發(fā)明專利]用于檢測斯氏弓形菌的熒光PCR引物、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710060204.8
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106834463A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 游淑珠;馮家望;王小玉;蔡教英;姚麗鋒;丁琦;唐食明;符家忍
• 申請（專利權(quán)）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44205
• 代理人: 俞梁清

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，具體涉及斯氏弓形菌檢測用引物和探針組、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

弓形菌(Arcobacter)是一種新型食源性致病菌，國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)2002年將其規(guī)為對人類健康有嚴(yán)重危害類微生物。弓形菌中的布氏弓形菌(A.butzleri)、嗜低溫弓形菌(A.cryaerophilus)和斯氏弓形菌(A.skirrowii)被認(rèn)為與人類疾病相關(guān)。

弓形菌與彎曲菌親緣關(guān)系近、形態(tài)相似，呈彎曲或螺旋形桿狀、不產(chǎn)芽胞，但兩者生長特性有一定差異，弓形菌較彎曲菌生長溫度范圍更廣、氧氣耐受性更強(qiáng)，因而較彎曲菌更易存活。生長溫度、氧氣耐受性的差異和其它生化特性常用于鑒別弓形菌屬和彎曲菌這2個屬。自從Ellis等1977年首次建立了弓形菌的分離方法以來，不同學(xué)者建立了多種不同的增菌和平板分離模式的傳統(tǒng)方法，其中以1999年Johnson和Murano建立的方法被認(rèn)為是最好的方法。但是，由于弓形菌的生理生化特性表型差異性較大，導(dǎo)致其難以依賴傳統(tǒng)的生理生化特性進(jìn)行弓形菌種間分型鑒定。有學(xué)者的人工添加實驗表明，添加了斯氏弓形菌的某些樣品采用傳統(tǒng)檢測方法無法分離出此菌。這與斯氏弓形菌比其它弓形菌對抗生素更敏感、其生長繁殖速度也較慢有關(guān)，因而比其它弓形菌更難在含抗生素的培養(yǎng)基上生長。弓形菌檢測的傳統(tǒng)增菌平板分離方法與其它微生物傳統(tǒng)檢測方法一樣，用于弓形菌的檢測同樣存在步驟復(fù)雜、檢測周期長等許多的不足，非常有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測斯氏弓形菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測斯氏弓形菌的熒光PCR引物、試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于檢測斯氏弓形菌的熒光PCR引物及探針，其是根據(jù)斯氏弓形菌的23S rRNA基因特異性序列所設(shè)計的。

所述引物及探針的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-ATGCTCGTCATCGTAGGGTT-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-AGCGGATTTGCCTACTTAACAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

探針：HEX-ATCGAGGTCACGGATGGAAGTGT-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

一種用于檢測斯氏弓形菌的試劑盒，其包括以上所述的熒光PCR引物及探針。

斯氏弓形菌的熒光PCR檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取樣品DNA；

(2)以樣品DNA為模板，利用上述的熒光PCR引物、探針進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；

(3)根據(jù)擴(kuò)增曲線來判斷樣品中是否含有斯氏弓形菌。

熒光PCR擴(kuò)增體系中含有以下組分：

熒光PCR擴(kuò)增的程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性20s，60℃退火1min，收集熒光，40個循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的實時熒光PCR反應(yīng)方法結(jié)合上述引物和探針組具有以下特點：特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測快速可靠、操作簡便的特點。

附圖說明

圖1為實施例1中進(jìn)行實時熒光PCR的結(jié)果示意圖；

圖2、圖3為實施例1中進(jìn)行2株斯氏弓形菌的實時熒光PCR擴(kuò)增曲線的結(jié)果示意圖；

圖4、圖5為實施例3中進(jìn)行靈敏度實驗的結(jié)果示意圖。

具體實施方式

實施例1檢測斯氏弓形菌的熒光PCR檢測方法的建立

1、引物設(shè)計

根據(jù)斯氏弓形菌的23S rRNA基因特異性序列設(shè)計了一對特異性引物，序列如下所示：

上游引物：5’-ATGCTCGTCATCGTAGGGTT-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-AGCGGATTTGCCTACTTAACAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

探針：HEX-ATCGAGGTCACGGATGGAAGTGT-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

2、熒光PCR檢測

配置總體積為25μL的實時熒光PCR的反應(yīng)體系，具體為：