[發(fā)明專利]一個葉綠體定位基因ToxABP1-V及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710058370.4
• 申請日: 2017-01-23
• 公開（公告）號: CN108342392B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王秀娥;王宗寬;李穎波;樊安琪;張恒;趙佳;王海燕;肖進;曹愛忠;邢莉萍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發(fā)明公開了一個葉綠體定位基因ToxABP1?V及其應(yīng)用。ToxABP1?V的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.3。該基因來自二倍體簇毛麥，能與白粉病抗性相關(guān)基因CMPG1?V互作，在抗白粉病二倍體簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)下調(diào)表達。通過單細胞瞬間沉默技術(shù)將該基因RNAi沉默載體pWMB006?ToxABP1轉(zhuǎn)化感病小麥品種揚麥158，結(jié)果表明瞬間沉默ToxABP1可以降低揚麥158的吸器指數(shù)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得3棵陽性RNAi轉(zhuǎn)基因植株，其對小麥白粉病表現(xiàn)出中高抗性水平。因此，ToxABP1?V可望用于基因工程育種。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個葉綠體定位基因ToxABP1-V及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Blumeria graminis DC f.sp.tritici)引起的小麥白粉病是小麥(Triticum aestivum L.,2n＝6x＝42,基因組AABBDD)最嚴(yán)重的葉部病害之一，在中國及其他許多國家廣泛發(fā)生。該病在小麥整個生育期都可發(fā)生，并且可侵害小麥地上植株各個部分，以葉片和葉鞘為主。

隨著栽培品種、栽培條件以及氣候條件的影響，目前我國小麥白粉病危害呈加重趨勢。白粉病能用殺菌劑防治，但化學(xué)防治必然增加人力、物力投入，而且還會引起環(huán)境污染等生態(tài)問題，因此發(fā)掘抗病基因、培育抗病品種是防治小麥白粉病的有效措施。明確小麥抗白粉病的機制，克隆抗病相關(guān)基因，可以為小麥白粉病防治、小麥抗白粉病育種提供重要的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

栽培小麥的近緣物種在長期進化和自然選擇過程中，保留了大量的抗病蟲害、抗逆、優(yōu)質(zhì)等有益基因，是普通小麥品種改良的重要基因來源，因此，研究和利用親緣物種抗病基因，是改良小麥抗病性的重要途徑。

簇毛麥(Haynaldia villosa L.,2n＝2x＝14,基因組VV,)是普通小麥的二倍體近緣物種，具有高抗白粉病的優(yōu)良性狀。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，來自簇毛麥的CMPG1-V基因受白粉病誘導(dǎo)快速上調(diào)表達，在抗白粉病中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。CMPG1-V基因編碼一個E3連接酶，參與泛素化過程，識別目標(biāo)底物蛋白并對其進行泛素化修飾(Hershko A,TheUbiquitin System.Springer,1998)，或與底物蛋白互作或通過26S蛋白酶體將底物蛋白降解。為篩選CMPG1-V基因的互作蛋白，構(gòu)建了簇毛麥葉片酵母雙雜交cDNA文庫(III Gold Cloning Kit,Stratagene)，以CMPG1-V基因為誘餌利用酵母雙雜交技術(shù)、篩選簇毛麥酵母雙雜交cDNA文庫，獲得了一個編碼ToxinA BindingProtein 1(ToxABP1-V)。該基因在簇毛麥葉片中受白粉菌誘導(dǎo)下調(diào)表達；利用單細胞瞬間沉默技術(shù)(參考文獻：Schweizer,P.,A.Christoffel and R.Dudler,Transientexpression of members of the germin-like gene family in epidermal cells ofwheat confers disease resistance.Plant J,1999.20(5):p.541-52.)對ToxABP1-V進行了功能驗證，結(jié)果顯示，利用基因槍在感白粉病的小麥品種揚麥158(公知公用材料,周祥勝等,小麥揚麥158的特征特性及其栽培要點.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),1999(06):13-14.)葉片中瞬間沉默ToxABP1，能夠顯著降低白粉菌的吸器指數(shù)；進一步利用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(邢莉萍.小麥/簇毛麥抗白粉病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化及功能鑒定[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007)，將ToxABP1-V基因的RNAi沉默載體pWMB006-ToxABP1轉(zhuǎn)化揚麥158中，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，分子鑒定和抗性鑒定結(jié)果表明，沉默該基因可以提高白粉病抗性，表明該基因在小麥白粉病抗性中發(fā)揮負調(diào)控功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一個葉綠體定位基因ToxABP1-V。

本發(fā)明的另一目的是提供該基因的RNAi沉默載體。