[發明專利]熊蜂短膜蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201710057647.1
• 申請日: 2017-01-26
• 公開（公告）號: CN106755495A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張體銀;鄭騰;李丹丹;白泉陽;王武軍;張志燈;于師宇
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種熊蜂短膜蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒，屬于動物衛生技術領域，適用于熊蜂短膜蟲病的檢測和診斷。

背景技術

熊蜂短膜蟲（Crithidia bombi，簡稱C. bombi）是熊蜂重要的寄生性原蟲，屬于動鞭毛蟲綱（Zoomastigophorea）動質目（Kinetoplastida）錐蟲科（Trypanosomatidae）短膜蟲屬Crithidia，只具錐蟲亞目6個發育期中的無鞭毛期和前鞭毛期兩個發育期。它是熊蜂最重要的病蟲害之一，感染個體壽命縮短，卵巢變小，蜂王巢穴和工蜂存活能力降低，嚴重影響熊蜂的健康 (Skykoff and Schmid-Hempel, 1992)，而且感染后癥狀并不明顯，也延誤了對該病的治療。熊蜂短膜蟲通過降低寄主熊蜂識別和采集花蜜能力，來改變寄主熊蜂的覓食行為，采集花粉的能力降低60%以上（Otterstatter et al., 2005）。這種覓食行為的變化，對需要其授粉植物的影響是不可預測的；同時，增加的采集能量支出，也影響到整個蜂群的健康（Schmid-Hempel et al., 2007）。通過對我國各地所采到的30份熊蜂樣品進行流行病學調查顯示，感染率達到了46.7%，感染狀況十分嚴重，另外熊蜂短膜蟲在夏季的感染情況是寄主冬季致死率的預測標記（Ravoet et al., 2013），夏季的高流行率預示著蜂群在越冬過程中存在著一定的死亡風險。熊蜂短膜蟲病的流行會降低該地區熊蜂的遺傳多樣性；反過來，熊蜂遺傳多樣性的降低，又會促進熊蜂短膜蟲病的發生，這種相互影響最終給經濟和生態帶來巨大的危害。

目前對于熊蜂短膜蟲的檢測主要根據病原形態學特征以鏡檢法為主，但這種方法需要豐富的臨床經驗，而且感染初期蜂群表面狀況良好，無任何臨床癥狀，所以極易造成漏檢，也容易和微孢子蟲病混淆。Salathé等（2012）介紹了一種用流式細胞儀從熊蜂糞便中分離和培養熊蜂短膜蟲的方法，但這種方法需要昂貴的儀器設備和專業的操作技術，不適宜在基層檢測部門推廣，另外Popp和Lattorff（2011）建立的一種體外培養單個寄生蟲菌株的方法也不適用于大批量熊蜂樣品的檢測。基因內轉錄間隔區（internal transcribed space, ITS）是位于寄生蟲的遺傳物質特別是核糖體DNA ( rDNA )上18S和28S rDNA之間的區域片段，作為一種遺傳標記，由于它在生物種和亞種間變異較大，已經被廣泛應用于寄生蟲的分類與鑒定、病原診斷等不同方面的研究（牛慶麗等, 2008）。

本發明利用熊蜂短膜蟲18S-28S rDNA ITS基因保守序列設計一對特異性引物和探針，通過對反應體系的優化，研制用于檢測熊蜂短膜蟲的實時熒光定量PCR試劑盒，具有靈敏性高、特異性和穩定性強、操作簡便等優點，該方法可在2 h內完成熊蜂短膜蟲的快速檢測，可滿足大批量樣品快速篩查的要求，可以在口岸檢驗檢疫和基層獸醫部門進一步應用和推廣。

發明內容

本發明的目的在于提供一種熊蜂短膜蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒，彌補現有檢測技術的不足，其具有特異性強、靈敏度高、操作簡單的特點，能夠對熊蜂短膜蟲進行快速、準確的檢測和診斷。

為了實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：

一種熊蜂短膜蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括正向引物Cri-F、反向引物Cri-R及TaqMan探針qPCR-P，各引物核苷酸序列如下：

正向引物Cri-F：5’-GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3’，

反向引物Cri-R：5’-GACGAGAAGG AGAGTAAG-3’；

TaqMan探針qPCR-P：5’-AACACACAAACAAACCAA ACACACA-3’，

探針的 5’端和3’端分別采用熒光基團FAM和TAMRA進行修飾。

其中，該試劑盒的具體試劑組成為：

（1）陽性標準品：100 μL濃度為1×10³拷貝/μL的陽性標準品1支，采用含有目的DNA片段的陽性質粒作為陽性標準品，-20 ℃保存。

（2）陰性對照：100 μL濃度為100 ng/μL的陰性對照1支，采用未感染熊蜂短膜蟲的健康熊蜂組織提取的總DNA為陰性對照樣品，-20 ℃保存；