[發明專利]一種油乳劑蛋白亞單位疫苗中蛋白含量和純度的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201710054110.X
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN107228910B
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;賈寶琴;查銀河
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發明提供了一種油乳劑蛋白亞單位疫苗中蛋白含量和純度的檢測方法及其應用，該方法包括：(1)準備標準蛋白；(2)使用芐醇從疫苗中分離出水相；(3)使用HPLC檢測(1)中準備的標準蛋白和(2)中分離出來的水相中的抗原蛋白；(4)根據標準蛋白的濃度和(3)中檢測出來標準蛋白對應的峰面積建立標準曲線，將(3)中檢測出來的水相中的抗原蛋白的峰面積代入標準曲線，計算得到水相中目的蛋白的濃度，從而換算得到疫苗中抗原蛋白濃度；(5)根據(3)中檢測出來的水相中的抗原蛋白的峰面積占所有峰面積的比例，確定疫苗中抗原蛋白的純度。本方法在抗原蛋白含量的定量及純度的檢測中準確率達到95％以上。

技術領域

本發明涉及一種油乳劑蛋白亞單位疫苗中蛋白含量和純度的檢測方法和應用，屬于生物技術領域。

背景技術

疫苗是目前預防傳染性疾病最有效的方法之一。除安全性外，評價一個疫苗的另一個重要指標就是其免疫原性。傳統的減毒活疫苗和滅活疫苗仍然是目前最為常用的疫苗，因為兩種疫苗都保持了良好的病毒顆粒性狀和病毒表面蛋白，并且減毒活疫苗還能在體內復制，能夠有效地誘導中和抗體產生。盡管這兩類疫苗目前都得到了廣泛的應用，但是其毒力返強和滅活不完全的安全性問題仍然不容忽視，尤其是對于那些生物安全級別很高的病毒；另外，這兩類疫苗生產工藝都較為復雜、成本較高。因此，利用重組技術來研發亞單位疫苗是現代疫苗學的一個新的方向和趨勢，這類疫苗不含病毒的基因組，是一類相對安全的疫苗。且對于那些我們目前還不能培養和有效擴增的病毒，或者是培養的生物安全級別要求很高的病毒，亞單位疫苗是首要的選擇。

基因工程亞單位疫苗(Subunitvaccine)又稱重組亞單位疫苗(RecombinantSubunit Vaccines)或生物合成亞單位疫苗，是利用DNA重組技術將編碼病原微生物保護性抗原的基因導入受體菌(如大腸桿菌)或細胞(如293T細胞)，使其在受體中高效表達，分泌保護性抗原，分離純化保護性抗原再加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。利用基因工程的方法，不僅能夠克隆得到編碼病毒保護性抗原的基因，而且能夠在體外對其進行改造或修飾，并重新轉移到異源生物宿主體內或培養細胞中，使病毒蛋白獲得大量表達。基因工程亞單位疫苗就是將保護性抗原基因在原核或真核細胞中表達，再以這種生物合成的基因產物制成的疫苗。因此，應用基因工程亞單位疫苗易于大規模生產，且成本低廉。用蛋白作為抗原建立的診斷方法，可以將免疫動物和自然感染動物鑒別開來，不干擾流行病學調查；對于發病急、病程短的疾病效果較好；因此它將成為近期投入市場品種最多的生物高技術產品。

在重組蛋白類疫苗的研發中，蛋白抗原與佐劑吸附后的穩定性也是必須的檢測指標之一，這就需要準確測定疫苗成品中的抗原含量。而疫苗成品多是抗原蛋白與佐劑吸附后的膠體狀復合物，如何采用適當的方法讓蛋白抗原與佐劑完全解離且不破壞抗原的性質，是需要重點解決的一個難題。目前的報道中，有采用檸檬酸鈉、鹽酸胍等方法將蛋白與佐劑解離的方法，但普遍存在解離不完全，解離時間偏長等問題。特別是在油乳劑疫苗中，由于疫苗本身為油狀，使用普通方法破乳解離抗原蛋白的得率很低，且容易導致抗原蛋白變性甚至降解。

目前在成品疫苗的質檢中，特別是獸用疫苗的質檢中，一般采用成品疫苗按照規定的免疫程序免疫靶動物，跟蹤后續的抗體效價結果或進行免疫攻毒實驗，從而驗證本批次疫苗是否符合要求，能否投入市場。因此，找到一種替代方法檢測成品疫苗中抗原的含量和純度是目前獸用疫苗的一個研究重點，這不僅能夠節約成本和時間，也能夠避免使用動物進行實驗，從而節約實驗動物的使用量。

發明內容

鑒于上述存在的油乳劑疫苗中抗原蛋白解離效率低且易變性降解的問題，以及在成品獸用疫苗的質檢中使用靶動物進行實驗從而導致成本較高、質檢時間長，且需要使用很多實驗動物的問題，本發明提供了一種快速檢測油乳劑亞單位疫苗中抗原含量和純度的方法。