[發(fā)明專利]一種真菌多糖類抗性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710053746.2
• 申請(qǐng)日: 2017-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN106929429A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉愛新;張莉;李現(xiàn)道;包自超;杜傳印;劉春菊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué);山東煙草研究院有限公司;山東濰坊煙草有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12P19/04;A01N43/16;A01P21/00;A01P1/00;C12R1/645
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司37205
• 代理人: 苗峻,趙斌

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于真菌多糖類抗性誘導(dǎo)劑領(lǐng)域，涉及一種真菌多糖類抗性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用，特別涉及一種馬勃多糖的獲得，以及其對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)的影響及對(duì)煙草花葉病毒的抑制作用。

背景技術(shù)：

真菌多糖是一類天然高分子化合物，它由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接在一起的多聚物構(gòu)成，是生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于真菌特別是大型真菌的細(xì)胞壁中，因其具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用而被醫(yī)藥界廣泛關(guān)注。真菌多糖有螺旋狀的三維立體結(jié)構(gòu)，其構(gòu)型近似于DNA，是一種β型的多糖。常見的有幾丁聚糖、氨基寡糖素、菇類蛋白多糖等，

煙草病毒病是煙葉生產(chǎn)中最重要的病害之一，被稱為植物“癌癥”，由于迄今為止尚無(wú)有效的防治措施，其造成的經(jīng)濟(jì)損失已大大超過了煙草真菌病害和細(xì)菌病害，成為威脅煙草生產(chǎn)的最大的一類災(zāi)害。

植物抗病誘導(dǎo)劑因其環(huán)境友好性、系統(tǒng)性、廣譜性等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛研究和應(yīng)用，潛力巨大。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道有大量的抗病誘導(dǎo)劑研制并成功應(yīng)用。許多研究表明，許多大型真菌多糖不僅具有抑殺真菌和病毒的作用，而且能夠調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。作為天然化合物，真菌多糖還具有無(wú)毒、易被降解、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特性，使其有可能作為一種新型植物抗病誘導(dǎo)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用。

而馬勃是常用的藥用真菌，其藥用成分包括馬勃多糖、甾體類化合物等，在抗腫瘤、抗炎、止血和抑菌等方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但在誘導(dǎo)植物抗病性和促生等方面尚未見相關(guān)研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的諸多不足之處，本發(fā)明首先提供了一種大型真菌，命名為馬勃(Calvatia sp.)DBM，并于2016年5月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12505；利用該真菌獲得的馬勃(Calvatia sp.)DBM多糖處理煙草幼苗后，煙草幼苗的鮮重、最大葉面積、葉綠素含量及凈光合速率等與對(duì)照相比均明顯提高。DBM多糖處理煙草葉片后，對(duì)煙草花葉病毒有較好的抑制效果。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供了一種大型真菌馬勃，馬勃樣品由發(fā)明人于2015年8月采自山東泰山，并分離獲得菌種，菌種現(xiàn)保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

獲得上述真菌后，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12505；

在上述真菌的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步給出了利用其制備馬勃多糖的方法如下：

用5mm打孔器從DBM菌落邊緣打取直徑5mm的菌落圓片，挑取一片接種于PDA培養(yǎng)基中央，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)7d后，采用相同的方法在菌落邊緣打取直徑5mm的菌落圓片4-5片轉(zhuǎn)接于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃，220rpm培養(yǎng)7d，5000rpm離心10min收集菌絲體，無(wú)菌水充分洗滌；

其中所述的DBM菌落為保藏編號(hào)為CGMCC No.12505的馬勃真菌菌落；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成按重量百分比計(jì)為：

冷榨豆餅粉，1％；酵母粉，0.2％；蔗糖，3％；硫酸鎂，0.05％；磷酸二氫鉀，0.1％；維生素B1，0.01％，余量為無(wú)菌去離子水；

菌絲體于65℃烘箱烘至恒重，干菌絲在研缽中研細(xì)，過80目篩子制成干粉；菌絲體干粉加40倍體積水80℃水浴浸提2h，重復(fù)兩次，合并兩次提取液，濃縮至原體積的1/15，向濃縮液中緩慢加入3倍體積的95％乙醇，4℃靜置過夜后8000rpm離心10min留取沉淀，沉淀分別以95％乙醇洗滌一次、丙酮洗滌兩次，真空干燥得到多糖粗提物。

對(duì)粗提物的理化性質(zhì)進(jìn)行初步鑒定發(fā)現(xiàn)，該粗提物為白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚和正丁醇。粗提物溶于水后為透明溶液，在較高濃度時(shí)呈粘稠狀。Molish反應(yīng)中，在粗提物溶液和濃硫酸的液面交界處形成紫環(huán)，表明粗提物中含有多糖成分。粗提物溶液與Fehling試劑反應(yīng)均顯陰性，沒有磚紅色沉淀產(chǎn)生，表明不含有還原性糖。

通過用苯酚-硫酸法測(cè)定得知上述獲得的DBM多糖粗提物中的總糖含量為84.9％。

發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)上述獲得的多糖粗提物進(jìn)行了功能研究，結(jié)果如下：

將上述多糖粗提物溶解后可獲得不同濃度的多糖溶液，選擇1000mg/L和2000mg/L兩個(gè)濃度的多糖溶液噴霧處理煙苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：