[發(fā)明專利]一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710053459.1
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106635971A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳海佳;葛嘯虎;王一飛;羅二梅;王小燕
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種軟骨細(xì)胞的分離方法，尤其是一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法。

背景技術(shù)

軟骨由軟骨組織及其周圍的軟骨膜構(gòu)成，軟骨組織是由膠原組織、少許細(xì)胞、以及60-80％的水份等成份所構(gòu)成。根據(jù)軟骨組織內(nèi)所含纖維成分的不同，可將軟骨分為透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨三種，其中以透明軟骨的分布較廣，結(jié)構(gòu)也較典型。每根骨的末端，都有一層軟骨組織包裹著。這些軟骨組織可使骨骼之間避免摩擦及沖擊。成人的軟骨組織中并沒有血管或神經(jīng)，因此軟骨組織受傷后自行修補的能力有限。

軟骨組織工程學(xué)是工程學(xué)與生物醫(yī)學(xué)尤其是細(xì)胞生物學(xué)相結(jié)合的邊緣科學(xué)，它涉及細(xì)胞、支架材料和包括多種生長因子在內(nèi)的發(fā)育環(huán)境3種基本要素。1988年Vacanti等將聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)作為支架，復(fù)合軟骨細(xì)胞后植入裸鼠皮下進行體內(nèi)培養(yǎng)，28天后發(fā)現(xiàn)有軟骨樣組織出現(xiàn)。1997年Cao等以一個3歲兒童耳廓作模型，用涂有PLA的PGA無紡網(wǎng)制成人耳形狀的支架，接種軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)1周后植入裸鼠皮下，12周后取出的標(biāo)本呈人耳狀軟骨，組織形態(tài)學(xué)檢查證實為軟骨組織。這一實驗的成功，標(biāo)志著預(yù)制人工軟骨的組織工程技術(shù)正在走向成熟。盡管目前軟骨組織工程的研究仍處在體外和動物體內(nèi)實驗階段，距離有效的臨床應(yīng)用尚有艱巨的道路要走，但其發(fā)展速度和臨床應(yīng)用前景已受到廣泛關(guān)注。

軟骨組織工程是將軟骨種子細(xì)胞種植于可生物降解、組織相容性好的生物材料形成復(fù)合物，然后再把該復(fù)合物植入軟骨缺損處，生物材料自行降解的過程中，種植的細(xì)胞形成新的軟骨來填充缺損。

在軟骨組織工程研究中對軟骨種子細(xì)胞的數(shù)量要求巨大、生物學(xué)功能活性要求高，軟骨種子細(xì)胞的來源仍是未很好解決的問題。雖然體外傳代培養(yǎng)可以擴增細(xì)胞數(shù)量，但軟骨細(xì)胞增殖能力有限，擴增達(dá)一定量后細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)制衰老和產(chǎn)生去分化及生物學(xué)功能衰退。因此，以有限的供體活組織收獲盡可能多而功能活性高的原代軟骨細(xì)胞，以降低體外擴增倍數(shù)，無論是在軟骨組織工程的研究中還是在臨床應(yīng)用中，都顯得非常重要。而目前常用的原代軟骨細(xì)胞分離方法收獲效率低，造成了供體活組織的浪費。且軟骨細(xì)胞得率低，活力較差，繼續(xù)擴增培養(yǎng)就仍然很難滿足自體軟骨細(xì)胞或組織移植的要求。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法，自體軟骨組織預(yù)處理后，剪碎，先用胰蛋白酶-EDTA處理，然后用Ⅱ型膠原酶溶液消化，待大部分細(xì)胞游離時，細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，離心棄上清，收集細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸后培養(yǎng)3天，收集貼壁細(xì)胞即得原代軟骨細(xì)胞。

其中，所述預(yù)處理為用含有雙抗的PBS溶液進行清洗，以清除自體軟骨組織表面的血污及附著的其他組織。所述預(yù)處理優(yōu)選在無菌條件下進行。

按照本發(fā)明，所述含有雙抗的PBS溶液中所述雙抗為青霉素和鏈霉素的混合物。其中所述青霉素終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml。

預(yù)處理后的自體軟骨組織需要先剪碎。優(yōu)選剪碎為剪成1mm³的大小。

本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法，先用胰蛋白酶-EDTA溶液處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述胰蛋白酶-EDTA溶液為含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液。

優(yōu)選的，按g/ml計，所述胰蛋白酶的終濃度為0.25％，所述EDTA的終濃度為0.02％。

本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法中所述胰蛋白酶-EDTA溶液處理時間優(yōu)選為5～10min。

在胰蛋白酶-EDTA溶液處理后還包括用PBS溶液清洗軟骨組織的步驟。優(yōu)選PBS溶液清洗軟骨組織3-5次。

進一步，本發(fā)明所述原代分離方法在胰蛋白酶-EDTA溶液處理后采用Ⅱ型膠原酶溶液消化。

優(yōu)選的，所述Ⅱ型膠原酶的終濃度為0.1v/v％～0.2v/v％。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述Ⅱ型膠原酶消化優(yōu)選為4℃消化過夜。在一些實施例中，消化時間為12小時左右。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞篩網(wǎng)為200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)。

優(yōu)選的，所述離心為1500rpm離心2次，每次5min。

本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的原代分離方法在離心后收集細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

其中，重懸后細(xì)胞密度為2×10⁵個/ml。