[發(fā)明專利]利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710053009.2
• 申請(qǐng)日: 2017-01-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106818459B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐祈林;王紅林;李曉鋒;程明軍;李楊;何如鈺;孫汝龍;李靜;謝孟林;嚴(yán)旭;趙艷麗;馬行云;穆罕默德·扎法爾·伊克巴爾;周樹(shù)峰;吳元奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H1/02
• 分類號(hào): A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 北京修典盛世知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 胡長(zhǎng)遠(yuǎn)

1.利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法，其特征在于包括以玉米異源六倍體為母本，以玉米為父本雜交，收獲結(jié)實(shí)籽粒，得F₁代；然后對(duì)F₁代的染色體組成進(jìn)行鑒定，選擇染色體總數(shù)為45～55條、且大芻草染色體數(shù)為1～20條的植株；再以所選的植株為母本，以玉米為父本回交，獲得BC₁代；對(duì)BC₁代進(jìn)行染色體組成進(jìn)行鑒定，然后選擇染色體總數(shù)為21～39條、且大芻草染色體數(shù)為1～5條的后代為母本，以玉米為父本繼續(xù)回交，得BC₂代；選擇BC₂代中染色體總數(shù)為21，其中玉米染色體為20條、大芻草染色體數(shù)為1條的材料，即為玉米-大芻草單體附加系；其中所述的玉米異源六倍體是指MTF-1或其衍生系；所述的衍生系是指以MTF-1為母本，以玉米、四倍體多年生類玉米或摩擦禾為父本雜交，選擇包含玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾三個(gè)物種全套染色體的后代，所得的新的異源六倍體。

2.利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法，其特征在于其具體步驟如下：

（1）、從三月下旬開(kāi)始，分10批種植玉米，每批20株，每批間隔3天；四月上旬將玉米異源六倍體種植于花盆內(nèi)；

（2）、在吐絲前將玉米異源六倍體雌穗套袋，并在授粉前將其花絲剪短至2～3cm，然后以玉米為父本給玉米異源六倍體雌穗授粉，每個(gè)雌穗至少重復(fù)授粉3次，每次授粉后都在套袋上作標(biāo)記，成熟時(shí)收獲種子，獲得F₁代；

（3）、次年4月，將步驟（2）所得的F₁代種子種植在人工氣候箱的營(yíng)養(yǎng)缽中，在28℃、濕度為70%的條件下催芽，植株生長(zhǎng)至2葉1心時(shí)移栽至花盆中種植；待植株株高≥30cm時(shí)，在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時(shí)，取根尖，采用染色體壓片技術(shù)鑒定體細(xì)胞染色體數(shù)目，利用原位雜交技術(shù)鑒定染色體組成，每個(gè)單株至少統(tǒng)計(jì)50個(gè)細(xì)胞；選擇染色體數(shù)為45～55條、且大芻草染色體數(shù)為1～20條的植株做母本，在雌穗吐絲前套袋，吐絲后剪短花絲至1～2cm，以玉米為父本進(jìn)行授粉，在第1次授粉后隔2天重復(fù)授粉1次，每個(gè)雌穗至少重復(fù)授粉3次，成熟時(shí)收獲種子，得BC₁代；其中所述的玉米與步驟（1）一樣進(jìn)行分期種植；

（4）、按照步驟（3）中所述的方法種植所得的BC₁代，并按照步驟（3）中所述的方法采用染色體壓片和原位雜交技術(shù)對(duì)BC₁代根尖染色體數(shù)目和組成進(jìn)行鑒定；選擇BC₁代中染色體總數(shù)為21～39條且大芻草染色體數(shù)為1～5條的植株；用玉米作為父本給所選的BC₁代植株授粉，收獲得BC₂代；

（5）、按照步驟（3）中所述的方法種植BC₂代，采用染色體壓片技術(shù)對(duì)根尖染色體數(shù)目進(jìn)行鑒定，BC₂代材料染色體總數(shù)只有20條和21條的兩種類型；

（6）、利用火焰干燥法對(duì)步驟（5）中染色體數(shù)目為21條的植株剩余根尖進(jìn)行染色體制片，選擇染色體處于中期且分散度較高的根尖燃片進(jìn)行雙色基因組原位雜交，分別用地高辛和生物素標(biāo)記玉米和大芻草總基因組DNA，鑒定染色體組成；選擇根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為21條，且其中含有20條玉米染色體和1條大芻草染色體的材料，即為玉米-大芻草單體附加系；

所述的玉米異源六倍體均指MTF-1或其衍生系；

所述的衍生系均指以MTF-1為母本，以玉米、四倍體多年生類玉米或摩擦禾為父本雜交，選擇包含玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾三個(gè)物種全套染色體的后代，所得的新的異源六倍體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的玉米是指普通栽培玉米，所述的玉米是雜交種、自交系、地方品種或綜合種。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其步驟（3）中所述的染色體數(shù)為45~50條；所述的大芻草染色體數(shù)為1~10條。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其步驟（3）、（4）或（5）中所述的染色體壓片的方法為：在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時(shí)，取根尖，并用α-溴萘飽和水溶液預(yù)處理3 h，將預(yù)處理后的根尖在室溫下用雙蒸水低滲30min，然后用甲醇和冰乙酸以體積比為3：1的比例配制的新鮮固定液固定12h以上，再將固定后的根尖置于70%無(wú)水乙醇中，保存在4℃中過(guò)夜，用雙蒸水洗凈根尖上的固定液，用等量混合的6%纖維素酶與1%果膠酶，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡寶品紅染色進(jìn)行壓片，顯微照相并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。