[發(fā)明專利]一種用于DNA純化的蛋白質(zhì)及其編碼基因、應用和純化方法

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• 申請日: 2017-01-23
• 公開（公告）號: CN108342384A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發(fā)明（設計）人: 曾鳴;王小軍;張臣良;張婷;唐子執(zhí);劉聰;姜長安
• 申請（專利權(quán)）人: 成都分子脈象生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C07K14/00
• 代理公司: 北京弘權(quán)知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于DNA純化的蛋白質(zhì)，及其編碼基因、應用和純化方法。本發(fā)明所述編碼用于DNA純化的蛋白質(zhì)的基因，該基因具有如下序列之一：(i)具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；(ii)在(i)所述序列的3’端融合了蛋白標簽編碼序列的核苷酸序列。本發(fā)明基因編碼的蛋白質(zhì)可有效地純化DNA，尤其是含有TetO序列的DNA，并且可高效純化微克以下含量級別的DNA，尤其是100納克以下含量級別的DNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于DNA純化的蛋白質(zhì)，及其編碼基因、應用和純化方法。

背景技術(shù)

高度純化的DNA是開展很多分子生物學實驗的先決條件。例如，限制性內(nèi)切酶反應、連接酶反應、PCR反應和DNA文庫構(gòu)建等體外反應，對溶液體系中的離子強度、污染蛋白水平、有機溶劑水平都有較高的要求。這些干擾因素不僅會嚴重降低體外反應的效率，也同時會導致非特異性酶切、連接產(chǎn)物比例的增高，因此DNA的純度是很多分子生物學實驗效率和準確度的決定因素之一。

目前常用的DNA純化方法有兩種：乙醇沉淀法和親和柱純化法。乙醇沉淀法利用DNA在70％乙醇溶液里溶解度較低的特點，將溶液中的DNA沉淀出來，通過離心收集，獲得較純的DNA。親和柱純化法是利用DNA能被二氧化硅(SiO₂)、陰離子樹脂等基質(zhì)吸附的特性，將DNA溶液通過含有這些基質(zhì)的親和柱后，離心去除雜質(zhì)，然后將結(jié)合到柱上的DNA洗脫下來。其中SiO₂親和柱的應用尤其廣泛。雖然這兩種技術(shù)非常成熟，但它們一般只適用于1微克以上的DNA樣品。而對于幾百納克或更少的微量DNA樣品，純化過程的損失率很高，往往在70％以上，無法滿足后續(xù)實驗的要求。這兩種方法的另一個缺點是操作步驟比較繁瑣，不適用于高通量實驗。

發(fā)明內(nèi)容

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與基因的啟動子、增強子區(qū)域結(jié)合并改變基因表達水平的蛋白質(zhì)。由于不少轉(zhuǎn)錄因子能識別特定的DNA序列并與它們結(jié)合，理論上它們也可以用來作為一種“介質(zhì)”將含有特定序列的DNA從溶液里吸附出來。然而用轉(zhuǎn)錄因子作為DNA純化“介質(zhì)”至少有兩個問題：一個問題是它們與DNA的結(jié)合力較弱，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子-DNA復合體的分離常數(shù)(Kd值)都在10^-8-10^-6M，因此用它們進行DNA純化，效率很低。例如，多家實驗室的嘗試表明運用大腸桿菌中的Lac抑制因子(Lac Repressor)，能純化細菌裂解所釋放的質(zhì)粒DNA，但回收效率在30％以下。另一個問題是多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子從DNA結(jié)合位點解離的機制并不是非常清楚，在體外反應里，一般只能在變性條件下實現(xiàn)高效解離；親和純化DNA一般要求DNA與結(jié)合介質(zhì)或基質(zhì)的結(jié)合是可逆的，例如SiO₂與DNA的結(jié)合力與鹽濃度密切相關(guān)，因此用SiO₂親和柱進行DNA純化時可以在高鹽溶液里吸附DNA，然后用低鹽溶液將吸附的DNA洗脫下來，但對于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA后如何實現(xiàn)高效解離是個難點。

在本發(fā)明中，我們提供了一種全新的蛋白質(zhì)來進行DNA純化，解決了以上兩個問題。有鑒于此，本發(fā)明提供一種用于純化DNA的蛋白質(zhì)、及其編碼基因、應用和純化方法，該編碼基因編碼的蛋白質(zhì)可有效地用于純化DNA，尤其是含有TetO序列的DNA，并且可用于純化微克以下含量級別的DNA，尤其是100納克以下含量級別的DNA。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一方面的方案是一種編碼用于DNA純化的蛋白質(zhì)的基因，所述DNA含有TetO序列，所述基因具有：

(i)序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；或

(ii)在(i)所述序列的3’端融合了蛋白標簽編碼序列的核苷酸序列。

優(yōu)選的，(ii)所述的蛋白標簽編碼序列是編碼SNAP、CLIP、Halo或生物素化標簽中的任一序列。