[發(fā)明專利]存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710049216.0
• 申請日: 2017-01-23
• 公開（公告）號: CN106644903B
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉麗;張建寧;董京飛;田野;董信龍
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
• 主分類號: A61K31/685
• 分類號: A61K31/685
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標(biāo)代理有限公司 12103
• 代理人: 孫喬喬

本發(fā)明公開了一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用。本發(fā)明腦源性微粒的磷脂雙分子膜上富含磷脂酰絲氨酸和組織因子并攜帶神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物。本發(fā)明腦源性微粒具有制備治療創(chuàng)傷性顱腦損傷引發(fā)的凝血功能障礙藥物的用途。本發(fā)明腦源性微粒的分離提純鑒定方法為：采集腦創(chuàng)傷病人/健康人血液樣本；分離提純?nèi)嗽葱訠DMPs；應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定人源性BDMPs。本發(fā)明建立了一種靈敏、精確、定量的人源性BDMPs分離提純鑒定方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用特殊方法來研究或分析材料領(lǐng)域，更具體地是一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

微粒（Microparticles，MPs）是一類在某些生理或病理狀況下，由正常細(xì)胞出芽脫落的富含磷脂的顆粒，具有一定的促凝活性。目前在人體外周靜脈血中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些血細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒，如：血小板源微粒（Platelet derived MPs，PMPs）、內(nèi)皮細(xì)胞源微粒（Endothelial MPs,EMPs）等。研究結(jié)果顯示：MPs（如PMPs）具有較強的促凝活性與免疫炎癥功能，在血栓性相關(guān)疾病等領(lǐng)域中具有很大的研究價值。

創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是我們前期研究工作的重點，顱腦受到創(chuàng)傷后所引發(fā)的一系列病理反應(yīng)直接影響患者的生命及預(yù)后，而且病程發(fā)展很快。研究TBI的多種病理反應(yīng)及時阻斷病程的發(fā)展對疾病的預(yù)后有重大意義。

由于腦源性微粒（鼠源性）（Brain-derived microparticles，BDMPs）的概念與特性是我們團(tuán)隊首次在國際上報道，屬于最新的研究領(lǐng)域。另外，BDMPs的結(jié)構(gòu)非常微?。ㄖ睆?.1～1.0μm），使得分離提純鑒定工作十分困難；并且由于人體十分復(fù)雜而又極其精密，使得人體來源的BDMPs的分離提純鑒定與鼠來源的有很大區(qū)別，因此理論和前期工作的實踐都表明不能套用照搬鼠源性的實驗方案。所以急需一套人源性BDMPs的分離提純鑒定實驗方案以及應(yīng)用此套方案來探究人源性BDMPs的臨床特性。因此很有必要建立一種靈敏、精確、定量的人源性BDMP s檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決鼠源性腦源性微粒的提取方法不能應(yīng)用于人源性腦源性微粒的提取的問題，所提出一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒，所述腦源性微粒的磷脂雙分子膜上富含磷脂酰絲氨酸和組織因子并攜帶神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物。

一種上述存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒在制備治療創(chuàng)傷性顱腦損傷引發(fā)的凝血功能障礙藥物中的應(yīng)用。

一種上述存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒的分離提純鑒定方法，包括以下步驟：

a.采集腦創(chuàng)傷病人/健康人血液樣本：

采集腦創(chuàng)傷病人/健康人外周靜脈血放入枸櫞酸鈉抗凝管中，在常溫下進(jìn)行120g-150g離心20 min-30min；

b.分離提純?nèi)嗽葱訠DMPs：

Ⅰ.取上層血漿，在常溫下進(jìn)行1500 g-2000g離心20 min-30min；

Ⅱ.取上層血漿，常溫下13000 g-15000g離心2 min-5min；

Ⅲ.取上層血漿，4℃下100000 g -120000 g離心60min-70min，留取沉淀，即為BDMPs，用PBS重懸后分別得到病人/健康人的富含BDMPs的懸液，用于后續(xù)流式檢測；

c.體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞制備BDMPs作為流式細(xì)胞技術(shù)檢測的陽性對照：