[發(fā)明專利]一種用于NKT細胞培養(yǎng)的融合蛋白、編碼基因及應用

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• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106810612A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖洪寶
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳中健生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N5/0783;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司44217
• 代理人: 李琴

1.一種用于NKT細胞培養(yǎng)的融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與用于NKT細胞培養(yǎng)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。

2.權(quán)利要求1所述融合蛋白的編碼基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)在嚴格條件下與序列1限定的DNA片段雜交且編碼與用于NKT細胞培養(yǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子；

3)與1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且編碼與用于NKT細胞培養(yǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子。

4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組表達載體。

5.權(quán)利要求1所述融合蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求4所述重組表達載體在NKT細胞培養(yǎng)中的應用。

6.一種人NKT細胞的體外制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S100、包被細胞培養(yǎng)瓶：用杜氏磷酸鹽緩沖液配制包被液，所述包被液包括CD3單克隆抗體1-10μg/ml、如權(quán)利要求1中所述的融合蛋白5-25μg/ml；將所述包被液加入培養(yǎng)瓶中避光放置8-24h；

S200、單個核細胞的制備：抽取人體外周血，使用淋巴細胞分離液分離得到單個核細胞，使用含有自體血漿、人CD3單克隆抗體的淋巴培養(yǎng)液重懸細胞得到細胞懸液；

S300、NKT細胞的誘導擴增：移除包被液，加入所述細胞懸液至細胞培養(yǎng)瓶后，添加細胞因子形成持續(xù)的刺激，置于CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲得NKT細胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人NKT細胞的體外制備方法，其特征在于，所述步驟S100中，所述包被液中所述融合蛋白的濃度為10-15μg/ml、所述人CD3單克隆抗體的濃度為4-7μg/ml；取包被液10ml，加入到75cm²培養(yǎng)瓶中，4℃避光放置過夜，備用。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人NKT細胞的體外制備方法，其特征在于，所述步驟S200中，所述單個核細胞用DPBS清洗兩次，顯微鏡下觀察計數(shù)，使用含5％自體血漿、50ng/ml人CD3單克隆抗體的淋巴細胞培養(yǎng)液GT-T551重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞密度3×10⁶個/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人NKT細胞的體外制備方法，其特征在于，所述步驟S300包括如下步驟：

S301、移除包被液，用10ml DPBS輕輕漂洗一次，再用10ml GT-T551輕輕漂洗一次；

S302、加入所述細胞懸液至該培養(yǎng)瓶，然后加入重組人干擾素-γ至終濃度為500-1000IU/ml，置于37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

S303、分別加入重組人白介素-2至終濃度為500-1000IU/ml、重組人白介素12至終濃度5-50ng/ml、白介素15至終濃度5-50ng/ml；之后每3天向該細胞培養(yǎng)瓶中補加細胞培養(yǎng)液，補加的細胞培養(yǎng)液為含有0.5％自體血漿、50ng/ml的人CD3單克隆抗體、1000IU/ml重組人白介素-2、10ng/ml重組人白介素12、10ng/ml重組人白介素15的GT-T551培養(yǎng)基。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人NKT細胞的體外制備方法，其特征在于，所述步驟S303中，分別加入重組人白介素-2至終濃度為1000IU/ml、重組人白介素12至終濃度10ng/ml、白介素15至終濃度10ng/ml。