[發明專利]一種人正常陰道上皮3D分化培養物模型的構建方法與用途

有效

• 申請號: 201710048227.7
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106635962B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 李暉;葉立娜;朱雅琪;丘建斌;吳小婷
• 申請（專利權）人: 李暉
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種人正常陰道上皮3D分化培養物模型的構建方法，包括如下步驟：

A、人正常陰道上皮細胞原代分離培養：

（1）在病人或病人監護人知情同意的情況下，收集陰道癌患者手術切除的癌旁正常組織樣品；

(2) 消化液的配制：含膠原酶和分散酶均為0.2 mg/mL的原代上皮細胞生長培養基；其中，原代上皮細胞生長2D培養基的成分包括：DMEM與Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按體積比3:1混合的培養基，同時添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲狀腺氨酸、0.4-0.65％胰島素鐵硒傳遞蛋白、4-6μg/ml鐵傳遞蛋白、9-11ng/mL表皮生長因子、0.3-0.5μg/mL氫化可的松、35-45μg/mL慶大霉素、45-55nM calpeptin、35-45ng/ml重組人IL-1RA，及3μg/ml重組人R-Spondin-1；

（3）用95～100%的乙醇洗分離的組織樣品1次，再用0.01M，pH 7.4的PBS洗2次，然后將組織放入含冰上預冷PBS的無菌培養皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織中殘留的脂肪；

（4）將正常陰道組織樣品放入10倍于組織樣品體積的含步驟（2）所配制消化液的無菌培養皿中，37℃消化1～3小時；

（5）將消化后的組織低速離心1000 rpm 5分鐘，去除上清；

（6）將細胞沉淀重懸于2-5 mL的0.25%胰酶-EDTA中，置于冰上1小時或室溫消化10分鐘；

（7）然后加入10 mL含10% FBS的DMEM培養基，低速1000 rmp離心5分鐘，盡量將上清去除干凈；

（8）加入2 mL37℃溫水浴的5 mg/mL分散酶和200μL 的1 mg/mL DNase I，用無菌的P1000一次性塑料槍頭反復吹打樣品1分鐘；

（9）加入10 mL含10% FBS的DMEM，用40～70 μm孔徑的過濾器過濾細胞懸液，收集過濾后的細胞懸液，低速1000 rmp離心 5分鐘，去除上清；

（10）重懸細胞沉淀于2D培養基中，接種于T25或T75的培養瓶培養，培養條件是37℃、5%CO₂；

B、人正常陰道上皮細胞的傳代培養：

（1）當在T25或T75的培養瓶中培養的人正常陰道上皮細胞增殖至70～90%豐度時，用1×0.01M，pH 7.4 PBS洗滌細胞三次，再用0.05% 胰酶-EDTA消化單層細胞2～5分鐘；

（2）加入10 mL DMEM中和消化反應1～2分種；

（3）1000 rmp離心5分鐘，棄上清；

（4）以1:2，1:3，1:4或1:5比例重懸細胞沉淀于2D培養基，接種于培養瓶培養，培養條件是37℃、5% CO₂得到人正常陰道上皮細胞；

（5）必要時可將1×10⁶上皮細胞重懸于1-2 mL的含90%胎牛血清和10% DMSO的細胞凍存液中，儲存于液氮中備用；

C、人正常陰道上皮的氣-液3D培養：

（1）將0.4μm的Millipore公司的12 mm Millicell PCF insert， 放入六孔板中，每孔最多放三個inserts；

（2）用400μl 2D培養基重懸5x10⁵個的人陰道上皮細胞，然后接種到每個insert中；

（3）每個孔板內部即insert外圍加入2ml的2D培養基；

（4）將放有insert的六孔板放入濕熱培養箱中，37℃，5%CO₂培養時長為48小時；

（5）將insert內部及外部中的培養基更換為3D分化培養基；

3D分化培養基的配制：DMEM與F12按體積比1:1混合的培養基，同時添加0.5-1.2 μM胰島素、0.05-0.2μM鐵傳遞蛋白，0.05-0.15μM氫化可的松，0.005-0.015μM三碘甲狀腺氨酸，1-4μM腎上腺素，0.1-1ng/mL表皮生長因子，2 x 10^–8 -8 x 10^–8 M視黃酸，0.1-1 μM磷酸乙醇胺，0.1-1 μM氨基乙醇，1-5μM硫酸鋅，100 U/mL青霉素G硫酸，100μg/mL鏈霉素硫酸鹽，0.5-1.5 mM氯化鈣；

（6）將放有insert的培養皿放入濕熱培養箱中，培養15-17小時，使insert內部的細胞與細胞之間形成緊密連接；

（7）移除insert內部及外部所有的培養基，外部的培養皿中加入3D分化培養基，開始分化培養；

（8）在濕熱培養箱中培養陰道上皮細胞14-21天，培養條件為37℃，5%CO_2,每2-3天更換insert外圍的培養基。