[發明專利]一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片及其制備方法、檢測方法

在審

• 申請號: 201710047455.2
• 申請日: 2017-01-22
• 公開（公告）號: CN106811403A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 何方洋;馮才偉;湛劍龍;扶勝;侯璐偉;周繪;賈玲玲;付浩;席蕓蕓;易重任;謝體波;李平;趙正苗;朱亮;張鶴
• 申請（專利權）人: 貴州勤邦食品安全科學技術有限公司
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/04;C12R1/085
• 代理公司: 江蘇愛信律師事務所32241
• 代理人: 趙贊贊

技術領域

本發明屬于快速檢測領域，涉及微生物檢測技術，具體涉及一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，以及該測試片制備方法、檢測方法。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)在自然界分布廣泛，在各種食品中的檢出率也較高，造成這個現象的原因，往往是由于食品在食用前保存溫度不當，放置時間過長，使污染在食品中的蠟樣芽孢桿菌或殘存的芽孢得以生長繁殖，由于蠟樣芽孢桿菌會產生的熱穩定毒素，從而會導致食物中毒事件發生。蠟樣芽孢桿菌中毒的發病率較高，一般能達到60％～100％。國家質量監督檢驗檢疫總局2014年已通過《食品微生物含量指引》，指出每克即食食品含超過十萬個蠟樣芽孢桿菌，就不宜供人食用，可能危害食用者的健康。

目前食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測，主要采用國標《GB 4789.14-2014食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》的方法進行檢測，該方法為平板法，是經典的微生物檢測和鑒定方法，檢測結果具有準確可靠的特點，但是該方法耗時長，需要現配置培養基，操作步驟繁瑣，難以滿足快速檢測的實際需求。

紙片法的出現，彌補了平板法的缺點，逐步成為微生物檢測和鑒定的主要方法和標準,2007年，Petrifilm^TM測試片被正式列為中國出入境檢驗檢疫行業標準，該方法正逐漸被越來越多的食品生產加工企業及各類檢測機構所認可。目前市場上現有測試片的培養基載體為無紡布，其存在目標菌落在無紡布上擴散生長使菌落邊緣模糊的缺點，對結果判讀有影響。

發明內容

為了解決現有技術存在的問題，本發明提供了一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片及其制備方法、檢測方法。

技術方案：

一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，包括下層底板4，珍珠紙2，上層薄膜組件1和蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基，所述珍珠紙2中間具有圓形凹槽3，所述圓形凹槽3內均勻分布有蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基。

進一步蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基每100mL含有胰蛋白胨0.8～2.0g、牛肉浸出粉0.05～0.5g、氯化鈉0.1～1.0g、磷酸二氫鉀0.2～0.4g、磷酸氫二鉀0.2～0.4g、冷水可溶性膠0.5～2.0g、抑菌劑混合物100～500IU/mL、顯色酶解底物混合劑0.015～0.04g。

進一步顯色酶解底物混合劑由5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基-D-葡糖苷酸環己胺鹽、4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸環己胺鹽按重量比1:1:1:2混合組成。

進一步抑菌劑混合物為多粘菌素B、卡那霉素，頭孢克洛按重量比為2:2:1的混合物。

進一步珍珠紙圓形凹槽3直徑為50～65mm。

進一步測試片上層薄膜組件1上方粘貼有測試片標簽5。

本發明的另一個目的還提供了一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片的制備方法，包括如下步驟：

a.配制蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基：每100mL按照以下方式配制，稱量胰蛋白胨0.8～2.0g、牛肉浸出粉0.05～0.5g、氯化鈉0.1～1.0g、磷酸二氫鉀0.2～0.4g、磷酸氫二鉀0.2～0.4g、冷水可溶性膠0.5～2.0g，于燒杯中加蒸餾水100mL加熱攪拌溶解，在121℃高壓滅菌鍋條件下滅菌15min，冷卻至室溫后，依次加入經過濾滅菌的抑菌劑混合物10000～50000IU及顯色酶解底物混合劑0.015～0.04g，得到蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基，在0～4℃下冷藏備用；

b.各組件的前處理

上層薄膜組件1：在上層薄膜組件1的反面均勻敷上冷水可溶性凝膠，在正面貼上測試片標簽5，送輻照處理，輻照劑量為2KGy，使用前紫外滅菌30min；

下層底板4和珍珠紙2：下層底板4與珍珠紙2采用不干膠粘貼貼合在一起后，送輻照處理，輻照劑量為2KGy，使用前紫外滅菌30min；

c.蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基添加：將步驟b中經紫外滅菌后的下層底板4和珍珠紙2結合部件水平放置在水平臺面上，珍珠紙2中間圓形凹槽3開口向上，吸取1～3mL蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養基添加于圓形凹槽3內，使培養基均勻分布，無菌條件下35～85℃烘干4h后，置于0～4℃的無菌冷藏箱內，備用；

d.組裝測試片：將經上述步驟c后得到的測試片組件上貼上經步驟a處理后的上層薄膜組件1，具有測試片標簽5的一面向上，即得到快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片。