[發(fā)明專(zhuān)利]樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K、生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710046566.1
• 申請(qǐng)日: 2017-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107245099B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉巖松;郭曉霞;唐偉;柳項(xiàng);段茹;謝艷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 肽澤（武漢）生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/47
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/47;C07K1/06;C07K1/04;C12N15/87
• 代理公司: 北京華仲龍騰專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，所述細(xì)胞穿膜肽的氨基酸序列為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，能把與生物小分子共價(jià)或非共價(jià)作用相互結(jié)合，并攜帶生物小分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K，其特征在于,所述穿膜肽在C端或N端共價(jià)或非共價(jià)連接標(biāo)記物或載物分子，并攜帶標(biāo)記物或貨物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，所述標(biāo)記物選自由熒光素、生物素、親和基團(tuán)所組成的組。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，所述貨物分子選自由糖類(lèi)、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子或納米微球所組成的組。

6.一種權(quán)利要求1所述樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)稱(chēng)取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang樹(shù)脂或H-Arg(PBF)-2cl樹(shù)脂，倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量二甲基甲酰胺(DMF)，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂1～10倍摩爾量的每步投料的氨基酸，1～10倍摩爾量的碳二亞型縮合劑或苯并三唑鎓鹽型縮合劑溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氫呋喃(THF)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量DMF洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量DMF洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到Lys2-Lys)2-Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；

(8)將干燥后的肽-樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用TFA洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(9)運(yùn)用HPLC/MS或超濾法或高效毛細(xì)管電泳法進(jìn)行多肽的鑒定和純化后，得到所需多肽鏈hPP7K。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述樹(shù)枝狀人源性細(xì)胞穿膜肽hPP7K介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，包括以下步驟：

(i)將質(zhì)粒pEGFP或PdsRED與所述穿膜肽hPP7K分別混合于磷酸鹽緩沖液(PBS)中；

(ii)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的N/P比,調(diào)整兩者間N/P比；

(iii)養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，用沒(méi)有血清的培養(yǎng)基洗兩次，加入質(zhì)粒DNA和穿膜肽復(fù)合物加入到500ul培養(yǎng)基中；

(iv)6小時(shí)后去掉培養(yǎng)基加含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基；

(v)靜置1-4小時(shí)。