[發明專利]一種氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測方法

有效

• 申請號: 201710044829.5
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN106841595B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 張明翠;沈碧
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/52;G01N21/31;G01N33/574
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 任晨晨

1.一種氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a、制備氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵包被抗原和免疫原；

b、制備抗氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵抗體，所述抗體的效價達到1:64000；

c、將氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵包被抗原經包被液稀釋后包被于酶標板中，封閉、加入不同濃度的氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵標準液，以抗氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔抗體作為二抗，進行間接競爭酶聯免疫分析法；

d、以氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵標準液濃度的對數為橫坐標，吸光度值為縱坐標建立標準曲線，從而定量檢測出氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵的濃度；

所述氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵的制備方法包括以下步驟：

取0.5 g M_w=40000葡聚糖40溶解在10 mL去離子水中，然后加入7.5mL 0.4 g NaIO₄水溶液，在80℃攪拌30分鐘，移除加熱器加入5 mL的乙二醇阻止葡聚糖進一步氧化，最后用NaOH溶液調節pH為7；

1 mmol FeCl₃?6H₂O和2 mmol Fe(NH₄)₂(SO₄)₂?6H₂O混合溶解在10 mL去離子水中，然后與氧化葡聚糖溶液混合，快速加入5 mL 0.6 g NaOH溶液大力攪拌10分鐘，轉移到聚四氟乙烯內襯的高壓釜中，160℃水熱處理10 h，最后冷卻到室溫離心或磁分離收集，即可得到氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵；

所述步驟a具體包括以下步驟：

a-1、氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵50 μL溶于4 mL PBS溶液中或100 μL溶于3 mL PBS溶液中，然后加入0.1 mL濃度為1~10 mg/mL的羥基琥珀酰亞胺溶液和0.2mL濃度為1~10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液，震蕩15~30 min，加入0.2mL 1%牛血清白蛋白溶液，25℃反應2~4 h，將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析12 h收集，即得到氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵免疫原；

a-2、氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵 50 μL溶于4 mL PBS溶液中或100 μL溶于3 mLPBS溶液中，然后加入0.1 mL濃度為1~10 mg/mL的羥基琥珀酰亞胺溶液和0.2mL濃度為1~10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液，震蕩15~30 min，加入0.2mL 1%雞卵清白蛋白溶液，25℃反應2~4 h，將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析12 h收集，即得到氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵包被抗原；

所述氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵中含有的Fe₃O₄量為80 mM；

所述羥基琥珀酰亞胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液、牛血清白蛋白溶液、雞卵清白蛋白溶液均為相應的PBS溶液；

所述步驟b具體包括以下步驟：

b-1、首次免疫：將氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵免疫原與福氏完全佐劑等體積比混合后，背部皮下多點注射到動物體內，注射8~10個點，注射量為1~2mL /只；首次免疫三周后進行加強免疫；

b-2、加強免疫：將氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵免疫原與福氏不完全佐劑等體積比混合后，采取同樣的方式注射到動物體內，注射量為1mL/只；此后每隔兩周再進行一次加強免疫，期間采血測效價，直到抗體效價達到1:64000，進行最后一次加強免疫，從動物頸動脈采血，取血清部分制得氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵抗體；

所述步驟c具體包括以下步驟：

c-1、包被：用包被緩沖液將氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵包被抗原溶液稀釋200倍加入96孔酶標板中，100 μL/孔，4℃過夜；

c-2、封閉：PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3min，然后加入1wt%酪蛋白封閉，每孔200μL，37℃溫育1~2h；

c-3、加樣競爭：PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3min，然后將50μL 不同濃度的氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵標準液和50μL抗氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵抗體分梯度加入各孔中，37℃溫育1.5~2h；

c-4、加酶：PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3~5min，然后每孔加入100μLPBS稀釋的稀釋比為1/5000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，37℃溫育2~4h；

c-5：顯色: PBST溶液洗滌96孔酶標板3次，每次3~5min，然后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液進行顯色反應，37℃顯色30min；

c-6、終止：每孔加入50μL 2mol/L的H₂SO₄終止反應，在酶標儀上測定各孔在490nm處的吸光值。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標準曲線的線性方程為A=1.17651-0.07137lgC，其中A為490nm處吸光度值，C為氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵濃度。