[發明專利]無創產前胎兒β型地貧基因突變檢測文庫構建方法、檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201710044640.6
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106755486A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 王曉鋒;曾華萍;宋卓
• 申請（專利權）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司44281
• 代理人: 孫銀行,彭家恩

1.一種無創產前胎兒β型地貧基因突變檢測文庫構建方法，所述文庫用于通過高通量測序進行無創產前胎兒β型地貧基因突變的檢測，其特征在于，所述方法包括：

(a)對母體外周血游離DNA連接帶有特異標簽序列和任選的樣本標簽序列的接頭序列；

(b)使用預文庫擴增引物序列對上一步的連接產物進行預文庫擴增，其中所述預文庫擴增引物序列與所述接頭序列互補結合；

(c)將上一步得到的預文庫分為上游預文庫和下游預文庫，分別使用上游特異性引物組1和下游特異性引物組1對所述上游預文庫和下游預文庫進行特異性擴增，分別得到上游特異性擴增產物1和下游特異性擴增產物1，

其中，所述上游特異性引物組1包括用于擴增β型地貧基因的上游引物組1以及用于計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的上游引物組1；所述下游特異性引物組1包括用于擴增β型地貧基因的下游引物組1以及用于計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的下游引物組1；

(d)對所述上游特異性擴增產物1和下游特異性擴增產物1，分別使用上游特異性引物組2和下游特異性引物組2進行特異性擴增，分別得到上游特異性擴增產物2和下游特異性擴增產物2，

其中，所述上游特異性引物組2包括用于擴增β型地貧基因的上游引物組2以及用于計算胎兒游離DNA比例的上游引物組2；所述下游特異性引物組2包括用于擴增β型地貧基因的下游引物組2以及計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的下游引物組2；

并且，所述上游特異性引物組2相比所述上游特異性引物組1更靠近對應的擴增目標位點，所述下游特異性引物組2相比所述下游特異性引物組1更靠近對應的擴增目標位點；所述上游特異性引物組2和所述下游特異性引物組2的5’端含有用于高通量測序文庫的接頭序列；

(e)將所述上游特異性擴增產物2和下游特異性擴增產物2混合后，使用兩端的通用引物進行擴增，得到可上機測序的文庫。

2.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述上游特異性引物組1和下游特異性引物組1的5'端帶有用于分離擴增產物的修飾，優選帶有生物素修飾。

3.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述上游特異性引物組1中針對特定目標位點的引物的3’端，與所述上游特異性引物組2中針對該目標位點的引物的5’端有10-15個堿基的重合；所述下游特異性引物組1中針對特定目標位點的引物的3’端，與所述下游特異性引物組2中針對該目標位點的引物的5’端有10-15個堿基的重合。

4.根據權利要求1-3任一項所述的文庫構建方法，其特征在于，所述用于擴增β型地貧基因的上游引物組1序列如SEQ ID NO：1-7所示；

所述用于計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的上游引物組1序列如SEQ ID NO：8-17所示；

所述用于擴增β型地貧基因的下游引物組1序列如SEQ ID NO：18-25所示；

所述用于計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的下游引物組1序列如SEQ ID NO：26-35所示；

所述用于擴增β型地貧基因的上游引物組2序列如SEQ ID NO：36-42所示；

所述用于計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的上游引物組2序列如SEQ ID NO：43-52所示；

所述用于擴增β型地貧基因的下游引物組2序列如SEQ ID NO：53-59所示；

所述用于計算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點的下游引物組2序列如SEQ ID NO：60-69所示。

5.一種無創產前胎兒β型地貧基因突變檢測方法，其特征在于，所述方法包括對權利要求1-4任一項構建的文庫進行高通量測序得到測序讀長；然后，根據位點的唯一的特異標簽序列的總深度和突變等位基因的深度，計算胎源DNA含量并對地貧相關的突變進行分型以分析β型地貧基因突變情況。