[發明專利]一種結直腸癌抗原特異性T細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201710044530.X
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106884005A
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發明（設計）人: 樊克興;任濤;劉洋;王凱玲
• 申請（專利權）人: 樊克興
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京華旭智信知識產權代理事務所(普通合伙)11583
• 代理人: 瓊偉格

技術領域

本發明涉及免疫細胞領域，更具體地涉及結直腸癌抗原特異性T細胞的制備方法，以及由所述方法獲得的結直腸癌抗原特異性T細胞。

背景技術

結直腸癌是全球第三大最常見癌癥，每年有100萬左右的新增病例和超過50萬人死于該病。結直腸癌的治療以手術為主，并結合輔助放療、化療，雖然輔助放化療能在一定程度上延長患者的生存期，但也伴隨嚴重的副反應，且即使經過積極的聯合治療，該病依然存在很高的復發轉移率。目前迫切需要開發出能有效延長患者生存期，減少復發和轉移風險的治療策略。

轉化生長因子βII型受體(TGFβRII)和O位N-乙酰葡萄糖胺糖基轉移酶(OGT)基因的框移突變產生一種具有人白細胞抗原A2(HLA-A2)限制性的新生抗原，存在于20-40％HLA-A2限制性結腸癌患者并且不存在于正常人和其他腫瘤中，提呈后的抗原肽為SLYKFSPFPL和RLSSCVPVA。

越來越多的證據表明免疫系統可以預防腫瘤生長和轉移擴散。包括細胞因子、腫瘤疫苗、免疫效應細胞，以及基因改造T細胞受體、單克隆抗體等成為國內外免疫治療研發的熱點。目前已開展多項結腸癌免疫治療臨床試驗研究，包括促進免疫系統的細胞因子、免疫檢查點阻斷、抗原疫苗和過繼性細胞治療等。盡管目前基因改造細胞成為免疫治療中翹楚，但由于制備工藝復雜，并存在脫靶效應，使得其在治療實體瘤的臨床階段推進受到阻礙。

以往針對細胞因子誘導殺傷性細胞，自然殺傷細胞治療包括結腸癌在內的實體瘤的研究認為這些治療方法存在一定的療效，但由于缺乏抗原特異性文獻報道臨床治療效果參差不齊。

腫瘤細胞表面的抗原通過抗原提呈細胞(APC)加工成抗原肽與主要組織相容復合物(MHC)分子形成復合物提呈并參與活化給T細胞，形成腫瘤抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。腫瘤為了逃避識別，下調甚至不表達MHC分子，部分腫瘤患者免疫細胞數量下降功能低下都會造成腫瘤抗原無法提呈，導致T細胞無法活化。所以使用抗原呈遞細胞輔助形成殺傷性T細胞是常用的方法，但是這些方法不穩定且不夠方便。

綜上所述，尚需要更加有效簡單的免疫療法和抗原特異性T細胞更加簡單和高效的制備方法。

發明內容

為了解決現有技術面臨的問題，本發明人開發了一種制備抗原特異性T細胞，特別是結直腸癌抗原特異性T細胞的方法，其解決或部分解決了以上問題。

本發明的一個方面涉及抗原特異性T細胞的制備方法，其包括使T細胞與腫瘤特異性抗原共孵育。

進一步地，所述方法中的腫瘤特異性抗原可以為結直腸癌特異性抗原。

在一些實施方案中，所述結直腸癌特異性抗原為肽RLSSCVPVA。

在一些實施方案中，本發明方法中的T細胞在混懸液中，進一步地，所述混懸液可以為外周血單核細胞混懸液或者外周血。

在一些實施方案中，本發明方法中的T細胞為CD8+T細胞。

本發明的一個方面涉及由本發明方法獲得的抗原特異性T細胞，特別是結直腸癌抗原特異性T細胞。

本發明還涉及由本發明方法獲得的結直腸癌抗原特異性T細胞在制備用于治療結直腸癌的制劑中的用途。

本發明中使用的肽SLYKFSPFPL(下文可簡稱為“抗原肽1”、“1號肽”或“P1”)和肽RLSSCVPVA(下文可簡稱為“抗原肽2”、“2號肽”或“P2”)可以是化學合成的或者經生物工程技術產生的，其具有較高的，例如大于99％的純度，具有良好的均質性。直接使用肽RLSSCVPVA處理獲得抗原特異性T細胞的方法，步驟大為簡化，可重復性好，具有良好的可操作性和實用價值。

附圖說明

圖1示出制備的肽的純度；圖1A抗原肽RLSSCVPVA合成質譜分析的離子峰，在12.245’出現；圖1B抗原肽RLSSCVPVA合成質譜分析的主要碎片峰，僅有一個，該碎片分子量為931.76，豐度為100％，接近RLSSCVPVA的理論分子量。圖1C抗原肽SLYKFSPFPL合成質譜分析的兩個離子峰，分別出現在16.731’和21.317’。圖1D OGT抗原肽SLYKFSPFPL合成質譜分析的主要碎片峰，有兩個，碎片的分子量(豐度)分別為1198.70(99％)和1220.81(1％)，第一個碎片的分子量接近SLYKFSPFPL的理論分子量。

圖2示出了在不同效應細胞靶細胞比例(簡稱“效靶比”)情況下，使用1號肽(P1)、2號肽(P2)、1號肽和2號肽的等比例混合物(P1+2)以及未添加抗原肽(NP)的情況下，誘導產生的細胞毒性T淋巴細胞(下文簡稱“CTL”)對DLD1殺傷活力的影響。