[發(fā)明專利]無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測文庫構(gòu)建方法、檢測方法和試劑盒

在審

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• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106755485A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉鋒;曾華萍;宋卓
• 申請（專利權(quán)）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44281
• 代理人: 孫銀行,彭家恩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測文庫構(gòu)建方法、檢測方法和試劑盒。

背景技術(shù)

地中海貧血(簡稱地貧)是全世界的高發(fā)病率遺傳病之一，是由于人體基因突變或者缺失而導(dǎo)致α，β-珠蛋白肽鏈合成速率的不平衡，從而引起的溶血性貧血。地貧常見的兩種類型是α-地貧和β-地貧，α-地貧相關(guān)基因?yàn)镠BA2和HBA1，β-地貧相關(guān)基因?yàn)镠BB。地貧集中在熱帶和亞熱帶地區(qū)，多發(fā)生于地中海沿岸國家，其次為中東、印度、巴基斯坦、東南亞、中國南方和北非，美國是移民國家，其發(fā)生率也較高。我國長江以南各省是地貧高發(fā)區(qū)，廣東、廣西、海南、臺灣和香港等地受累人口超過2億。中國人群中，α-地貧的基因型別常見的有-α^SEA、-α3.7、-α4.2、α^CS、α^QS和α^WS，β-地貧常見的有26種基因突變型別。目前地貧尚無根治的方法，只能依靠傳統(tǒng)方法治療，即以輸血治療為主，價格昂貴，因此產(chǎn)前篩查和診斷對預(yù)防該種出生缺陷疾病具有重大意義。

1997年，盧煜明發(fā)現(xiàn)孕婦外周血漿中存在來自于胎兒的游離DNA，這一發(fā)現(xiàn)為通過孕婦外周血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和檢測胚胎基因型提供了新的可能，隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胚胎染色體異常(如21、18、13染色體非整倍體變異)以及部分大的拷貝數(shù)變異已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床產(chǎn)前篩查和診斷，但是孕婦體內(nèi)胎兒游離DNA僅占孕婦血漿中總游離DNA的3％-6％，對于胎兒無創(chuàng)式的遺傳性疾病的檢測帶來挑戰(zhàn)。

不斷有研究人員嘗試通過孕婦外周血游離DNA對胎兒地貧基因做出檢測，由于孕婦外周血中存在大量母源游離DNA，所以如何有效區(qū)分胚胎基因的突變，對檢測方法的靈敏度提出了很高的要求。目前臨床報道產(chǎn)前檢測地貧基因突變的方法有幾種：傳統(tǒng)的羊膜穿刺、腹絨毛活檢等，由于是有創(chuàng)傷性的操作，可能伴有胎兒損傷、流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)感染等風(fēng)險。利用母體血漿中游離胎兒DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷也有些研究。Chiu RW通過使用實(shí)時熒光PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對父源codons 41/42 4bp缺失的有效檢測，還有科研工作者發(fā)展了針對其他β地貧點(diǎn)突變的檢測方法，但由于檢測突變多為點(diǎn)突變，方法的特異性有待提高。對于α地貧突變的研究也有報道，Warunee Tungwiwat等人，建立了基于熒光定量PCR檢測α⁰缺失的方法，然而該方法的靈敏度有待提高。此外，多種高靈敏度的技術(shù)方法也被嘗試用于無創(chuàng)地貧檢測，如質(zhì)譜、數(shù)字PCR、COLD-PCR等。但這些基于單一位點(diǎn)的PCR技術(shù)的檢測方法存在一定的局限性，如血漿DNA低含量及高度片段化的特點(diǎn)，很可能會帶來PCR的假陰性。這種方法只能夠檢測與母親不同的特異性父源突變是否存在，而無法進(jìn)一步確定母源突變的存在與否。基于高通量測序技術(shù)的孕婦血漿游離DNA的全基因組測序或者目標(biāo)區(qū)域捕獲測序可以更加準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)對胎兒地貧基因的檢測，但全基因組測序的成本以及分析方法的復(fù)雜性和需要父母單體型等限制了在臨床上的應(yīng)用；目標(biāo)區(qū)域捕獲測序由于其目標(biāo)區(qū)域捕獲效率低，僅能實(shí)現(xiàn)對胎兒α^SEA缺失純雜合型的區(qū)分，并且還存在分型錯誤的可能。鑒于此，需要提供一種高精確度的無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒地貧基因突變檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測文庫構(gòu)建方法、檢測方法和試劑盒，能夠準(zhǔn)確、高效地檢測α型地貧基因突變，其結(jié)果與羊水穿刺檢測分型一致，但安全性、無創(chuàng)性和高效性方面明顯優(yōu)于羊水穿刺檢測。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測文庫構(gòu)建方法，上述文庫用于通過高通量測序進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變的檢測，上述方法包括：

(a)對母體外周血游離DNA連接帶有特異標(biāo)簽序列和任選的樣本標(biāo)簽序列的接頭序列；

(b)使用預(yù)文庫擴(kuò)增引物序列對上一步的連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)文庫擴(kuò)增，其中上述預(yù)文庫擴(kuò)增引物序列與上述接頭序列互補(bǔ)結(jié)合；

(c)將上一步得到的預(yù)文庫分為上游預(yù)文庫和下游預(yù)文庫，分別使用上游特異性引物組1和下游特異性引物組1對上述上游預(yù)文庫和下游預(yù)文庫進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，

其中，上述上游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點(diǎn)的上游引物組1；上述下游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個SNP位點(diǎn)的下游引物組1；