[發明專利]一種抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體及其制備方法

在審

• 申請號: 201710044138.5
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106589117A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 李麗琴;王建;程雪嬌;王宇鵬;孫珊珊;范慶增;王猛;甄盼盼;楊雪;于小婷;杜寧寧;姬榮曼;焦曉軍;余貴菊;崔志剛;張立會;姜淋潔;朱士江;王勇
• 申請（專利權）人: 天津市中升挑戰生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司12211
• 代理人: 張會雪

1.一種抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

(1)制備豬口蹄疫的高免雞蛋；

(2)利用高免雞蛋制備精制蛋黃抗體：

(a)分離高免雞蛋蛋黃；

(b)制備精制蛋黃抗體；

(i)除脂；

(ii)沉淀：采用-20℃預冷的體積濃度95％乙醇處理；

(iii)純化：采用-20℃預冷的體積濃度50％乙醇處理；

(iv)濃縮；

(v)滅活：采用二乙烯亞胺(BEI)做滅活劑，密封狀態下室溫靜置；

(vi)除菌：用微孔濾膜設備進行除菌過濾；

(3)抗體效價的測定。

2.根據權利要求1所述的抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

(1)制備豬口蹄疫的高免雞蛋；

(2)利用高免雞蛋制備精制蛋黃抗體：

(a)分離高免雞蛋蛋黃：

將步驟(1)得到的高免雞蛋清洗、消毒后，晾干，送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；

(b)制備精制蛋黃抗體：

(i)除脂：

取步驟(a)分離的蛋黃，向其中加入蒸餾水稀釋，并用鹽酸調節PH，靜置，取上清液；

(ii)沉淀：

在步驟(i)得到的上清液中加入-20℃預冷的體積濃度95％乙醇，置4℃條件下攪拌、離心，用無菌PBS緩沖液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；

(iii)純化：

將步驟(ii)得到的沉淀溶解液加-20℃預冷的體積濃度50％乙醇，置4℃條件下攪拌、離心，用無菌PBS緩沖液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；

(iv)濃縮：

將步驟(iii)得到的沉淀溶解液經超濾濃縮儀過濾濃縮，得到濃縮液；

(v)滅活：

在步驟(iv)得到的濃縮液中加入滅活劑二乙烯亞胺(BEI)充分混勻，二乙烯亞胺(BEI)的終濃度為3mmol/L，在密封狀態下室溫靜置12小時，得到滅活液；

(vi)除菌：

將步驟(v)得到的滅活液用微孔濾膜設備進行除菌過濾，得最終的蛋黃抗體提取液；

(3)抗體效價的測定。

3.根據權利要求1或2所述的抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)制備豬口蹄疫的高免雞蛋的方法包括如下步驟：

(a)選擇未經人工免疫的健康蛋雞，經檢測為豬口蹄疫病毒陰性；

(b)免疫：用市售豬O型口蹄疫滅活疫苗免疫步驟(a)處理過的蛋雞；其中，免疫程序包括：基礎免疫、加強免疫和維持免疫；

(c)高免雞蛋的收集：

用所述步驟(b)中的疫苗免疫步驟(a)處理過的蛋雞，進行免疫程序后，從基礎免疫完成后，開始收集雞蛋，即為豬口蹄疫的高免雞蛋。

4.根據權利要求3所述的抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：所述步驟(a)中的蛋雞滿足以下條件：正值產蛋高峰、約200-400日齡的健康海藍白產蛋雞；將該蛋雞隔離飼養，同時按照每公斤體重加喂8mg頭孢曲松鈉，以預防細菌感染。

5.根據權利要求3所述的抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：所述基礎免疫包括首免、二免和三免；所述首免為每只雞腿肌或胸肌多點注射1.5ml疫苗；所述二免為在首免15天后，每只雞腿肌或胸肌多點注射1.5ml疫苗；所述三免為在二免15天后，每只雞腿肌或胸肌多點注射2ml所述疫苗；所述加強免疫為基礎免疫完成后，隔一個月進行一次加強免疫，每只雞腿肌或胸肌多點注射2ml所述疫苗，加強免疫共做2次；所述維持免疫為加強免疫后，每隔一個半月進行一次免疫，每只雞腿肌或胸肌多點注射2ml所述疫苗，直至該產品停止生產。

6.根據權利要求1或2所述的抗豬口蹄疫精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：所述步驟(i)除脂的方法為：

取分離的蛋黃，刺破蛋黃膜，收集無膜蛋黃并計量其體積；

然后將所得無膜蛋黃加入滅菌容器中，向其中加入蒸餾水稀釋蛋黃液，并用磁力攪拌器攪拌，混勻后靜置30min；

用鹽酸調節pH至5.0-5.5，置4℃條件下靜置過夜，次日，吸取上清液。